Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4⁺ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Dit protocol biedt een platform voor het bestuderen van CD4T-celreacties die vaak zwak en moeilijk te detecteren zijn. Deze techniek maakt het mogelijk voor de detectie, opsoming en isolatie van CD4T cellen zonder voorkennis met betrekking tot antigeen presentatie. Het belangrijkste voordeel is de analyse van CD4T cellen die vrij vaak zeldzame populaties geassocieerd met auto-immuunziekten zoals type een diabetes.

Bij het verkrijgen van het perifere bloedmonster van een gezonde donor, verdun het bloed in PBS in ten minste een tot twee verhouding voordat gelaagdheid 35 milliliter bloed meer dan 15 milliliter dichtheidsgradiënt medium in een 50 milliliter buis. Scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en verwijder ongeveer 20 milliliter van de resulterende bovenste plasmalaag. Dan verzamelen van de witte bloedcel laag verzorgen om de rode bloedcel pellet te voorkomen en was de cellen drie keer in verse PBS.

Verdun de cellen na het tellen één keer 10 tot de zesde perifere bloedmonnucleaire cel of PBMC per milliliter PBS-concentratie. Voeg 300 microliter cellen voor elke controle in individuele 10 milliliter buizen. Na topping elke buis met PBS, sediment de cellen door centrifugatie en resuspend de cellen op een een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van RP5 medium concentratie.

Dan plaat 100 microliter cellen per controle op elk van de drie putten van een 96 put plaat met 100 microliter van RP5 medium per put. Plaats de plaat zeven dagen in de couveuse van de celkweek. Breng vervolgens de resterende PBMCs over in een nieuwe buis van 50 milliliter en voeg één microliter CFSE-werkvoorraadoplossing per milliliter celsuspensie toe aan de zijkant van de buis.

Snel de buis meerdere keren omkeren en plaats de cellen in een celcultuur incubator gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, arresteer de reactie met vijf milliliter RP5-medium en verzamel de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet op een keer 10 tot de zesde PBMCs per milliliter van verse RP5 medium en voeg een milliliter cellen aan een 10 milliliter buis per te testen antigeen.

Voeg vervolgens 100 microliter cellen per antigeen toe aan elk van de drie putten van een 96 putplaat goed met 100 microliter van RP5 medium aangevuld met het verdunde antigeen van belang per put. Plaats de plaat zeven dagen in de couveuse van de celkweek. Om de CD4+T-celpopulaties te bevlekken voor stromingscytometrische analyse, breng aan het einde van de cultuur het volledige volume cellen van elke bron over naar individuele fluorescentie geactiveerde celsorterende of FACS-buizen.

Was elk monster met een milliliter PBS aangevuld met 0,1% foetale kalf serum of FCS. Resuspend de pellets in een geschikte anti-menselijke CD4 antilichaam in 100 microliter van PBS plus FCS per buis. Incubeer de cellen op vier graden Celsius gedurende 20 minuten beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters in een milliliter verse PBS plus FCS per buis en resuspend de pellets in 100 microliters van verse PBS plus FCS. Voeg vlak voor de analyse één microliter propidiumjodide toe aan elke buis om uitsluiting van dode cellen mogelijk te maken. Poort de lymfocyten volgens hun voorwaartse en zijverstrooiingsgebieden.

Om de apoptotische cellen uit te sluiten, poort het voorwaartse verspreidingsgebied versus propidium jodide negatieve cellen en gebruik de niet-gekleurde cellen om een spanningsbasislijn voor de niet-fluorescerende cellen in te stellen. Stel de spanningen voor de CD4 antilichaamfluorofoforeren en het CFSE-signaal zo in dat het tl-signaal voor elk van deze signalen onder de 1000 ligt. Gebruik de CFSE- en CD4-monsters met één kleur om een positief fluorescerend signaal voor elke kleur te bevestigen met behulp van de spanningen die zijn ingesteld met de niet-gekleurde cellen.

Aangezien CFSE en propidium jodide enige spectrale overlap hebben, past u de compensatie aan om de propidium jodidefluorescentie af te trekken van de CFSE-fluorescentie totdat het CFSE-monster geen signaal oplevert in het propidiumjodidekanaal. Wanneer alle monsters zijn geanalyseerd, bereken de celdelingsindex door het aantal verdeelde cellen te delen door 5000 onverdeelde cellen van de door antigeen gestimuleerde groep door het gemiddelde aantal verdeelde cellen per 5000 onverdeelde cellen van de cellen die zonder antigeen worden gekweekt. Bijna alle donoren vertonen een sterke T-cel respons op Tetanus toxoïde na in vitro stimulatie, omdat de donoren zijn gevaccineerd waardoor Tetanus toxoïde een nuttig positief bestrijdingsantigeen is.

De proliferatie van CD4+T-cellen uit niet-geprikkelde PBMCs is echter minimaal. Na zeven dagen van stimulatie met menselijke pro-insuline C-peptide, pro-insuline C-peptide specifieke CD4 + T cellen kunnen worden gedetecteerd in het perifere bloed van een individu met type een diabetes. PBMC gestimuleerd met influenza Een virus matrix eiwit tonen ook proliferatie.

Samen tonen deze gegevens aan dat de test kan worden uitgevoerd met behulp van volledige lengte eiwitten en korte synthetische peptiden. De FACS-component van deze methode kan worden uitgevoerd met behulp van een celsorteerstroomcytometer. Met behulp van een celsorteerder kunnen de antigeenspecifieke T-cellen op het niveau van één cel worden geïsoleerd voor downstream-analyse.

Deze methode heeft toegestaan voor de ontdekking van CD4T celreacties bij personen met een vroeg begin type een diabetes. Het analyseren van deze zeldzame T-cel populaties met behulp van andere methoden presenteert verschillende technische uitdagingen.