Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

Systeembrede studies zijn cruciaal voor het diepgaande begrip van de biologische functies. Er zijn echter meerdere onafhankelijke monsters nodig voor verschillende omics-platforms, waardoor de gegevens een hoge mate van variabiliteit bevatten. Deze methode biedt een robuuste en hoge doorvoerstrategie voor gelijktijdige extractie van chlorofyl, lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster van het model groene alg, Chlamydomonas reinhardtii.

Voor chlorofyl, lipide, en metaboliet extractie, schik de buizen van geoogste Chlamydomonas cel pellets in vloeibare stikstof. Resuspend de pellet in elke buis met een milliliter van 20 graden extractie buffer een. Om verdamping van de lage viscositeitextractiebuffer te voorkomen, moet de buizen snel worden geherwerd totdat de cellen goed gehomogeniseerd zijn in het extractiemengsel en de oplossing in twee milliliter microcentrifugebuizen worden gehersensmiseerd.

Soniceer de culturen in een sonicatiebad in ijskoud water gedurende 10 minuten voor incubatie op een orbitale shaker bij 1.000 rotaties per minuut gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie 650 microliters extractiebuffer twee toe en draai de monsters kort voordat ze worden gecentrifugeren. Om de fracties te aliquoteren, breng 500 microliters van de bovenste MTBE lipidefase over in een gelabelde 1,5 milliliter buis.

Gebruik een 200 microliter pipet om de lipidefase te verwijderen en 650 microliters van de lagere polaire en semipolaire metabolietfase over te brengen naar nieuwe gelabelde buizen. Het overtollige volume aanzuigen om de resterende onderste fase te verwijderen en de vaste pellets in vloeibare stikstof te bevriezen voor 80 graden opslag. Voor de bepaling van polaire metaboliet, resuspend de gedroogde pellet van de polaire fase in methoxyamine hydrochloride pyridine oplossing voor methoxymisatie van de carbonylgroepen en verwarm de monsters op 30 graden Celsius gedurende 90 minuten.

Aan het einde van de incubatie, derivatiseren van de monsters met n-methyl-n-trifluoracetamide gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius volgens de standaard protocollen. Gebruik gaschromatografie gekoppeld aan time-of-flight massaspectrometrie om de primaire metabolieten te analyseren. Voor niet-polaire metabolietbepaling, resuspend de gedroogde pellet van de niet-polaire fase in een mengsel van zeven tot drie volume tot volume acetonitril aan isopropanol en sediment de pellets door centrifugatie.

Scheid vervolgens de monsters op een omgekeerde fase C8-kolom op een ultraperformance vloeistofchromatografiesysteem. Voor de bepaling van chlorofylgehaltes mengt u 100 microliter van de MTBE-fase met 900 microliter van 90% methanol voor methode blanco en de experimentele monsters. Meet vervolgens de absorptie op een spectrofotometer op golflengten van 655 en 652 nanometer om onderscheid te maken tussen chlorofyl a en chlorofyl b en het chlorofyl a en b-gehalte en het totale chlorofylgehalte te berekenen.

Los voor eiwitextractie de onderste fasepellet op in 200 microliter eiwitbuffers en ontcubeer het monster 30 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren het monster en breng het eiwithoudende supernatant naar een nieuwe buis. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.

Om het eiwit te verteren, verminderen 15 microgram van het monster in vijf millimolar dithiothreitol gedurende 30 minuten, gevolgd door alkylation met 10 millimolar iodoacetamide gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Meng aan het einde van de alkylation de oplossing Trypsin/Lys-C bij een 25-1 eiwit om de proteaseverhouding te ontwikkelen en het monster drie uur lang uit te broeden bij 37 graden Celsius. Verdun het monster verzesvoudigd in 50 millimolar tris Hcl voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend beëindigt u de vertering met trifluoroacetisch zuur tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 tot 1%Na de spijsvertering concentreert u de monsters tot bijna droogheid, waarbij twee tot vijf microliter oplossing in een vacuümconcentrator overblijft zonder verwarming. Het monster opnieuw opschorten in de laadbuffer. Analyseer de peptidemengsels door vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer aangesloten op een nano ultra druk vloeibare chromatografie systeem.

Om de peptiden te scheiden, laadt vier microliter van het monster op een 20 centimeter omgekeerde fase geladen oppervlak hybride kolom met een binnendiameter van 75 micrometer en een deeltjesgrootte van 1,7 micrometer. Gebruik offline instellingen voor gedeeltelijke lus met een isocratisch verloop dat is ingesteld op 3% van de buffer B, die 14 minuten wordt vastgehouden voordat de lus wordt verschoven naar de online positie met de kolom, waarna het verloop gedurende 50 minuten lineair wordt verhoogd totdat 20% buffer B is bereikt. Een verschuiving in het celvolume kan worden waargenomen als de cellen in omvang groeien gedurende de lichtfase, gevolgd door het vrijkomen van dochtercellen vanaf het einde van de lichtfase vanaf 10 uur.

Zodra alle dochtercellen zijn vrijgegeven, kan een verschuiving in het celvolume worden waargenomen, aangezien de onlangs vrijgegeven dochtercellen worden verwijderd om de volgende cyclus te beginnen. Op basis van de gaschromatografie massaspectrometrie analyse van de polaire fractie, in dit representatieve experiment, werden 65 metabolieten geannoteerd. De vloeibare chromatografie massaspectrometrie analyse van de lipide-bevattende neutrale fase leidde tot de identificatie van 204 verschillende lipidesoorten die verschillende lipideklassen behandelen.

De belangrijkste componentanalyse kan worden gebruikt om globale verschuivingen in de metabolieten en lipiden over de celcyclus met een scheiding van licht en donkere fasen evenals semi-cyclische fasen te visualiseren die voor zowel metabolomics als lipidomic gegevens worden waargenomen. Hier wordt een overzicht getoond van de functionele verrijking van 2, 463 geïdentificeerde verrijkte eiwitten. De resterende pellet na eiwitextractie kan worden gebruikt voor reproduceerbare kwantificering van het zetmeel, zoals blijkt uit de lage standaardafwijking tussen verschillende replicaties.

Het is belangrijk om te voorkomen dat het drogen van de bovenste chlorofyl organische fase, omdat dit de niveaus van chlorofyl in het oplosmiddel kan beïnvloeden, die de normalisatiefactor voor de monsters beïnvloeden. Voor de biochemische karakterisering van de geëxtraheerde moleculaire soorten kunnen verschillende analytische procedures worden toegepast.