Bouw van CRISPR Plasmids en detectie van knock-out efficiëntie in zoogdiercellen door middel van een Dual Luciferase Reporter System

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen in het genereren en optimaliseren van efficiënte sgRNA-vectoren. Onze preacceleratie van kandidaat sgRNA richt zich op relatieve tijd en gevolgtrekking. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het mogelijk is om de DNA-coderingsverdrukken voor elk van de sgRNAs te analyseren zonder endogene genen te bewerken.

Deze preselectiemethode kan ook worden toegepast op andere genbewerkingsmaatregelen door middel van dubbelstrengs pauzes. Begin met het verdunnen van de lyophilized oligonucleotiden tot een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar in dubbel gedestilleerd water. Meng oligonucleotiden naar voren en achteruit in een dunne PCR-buis met een één-op-één-verhouding zonder extra buffer toe te voegen.

Broed het mengsel vijf minuten lang op 95 graden Celsius en haal de temperatuur vervolgens 10 minuten naar beneden naar 72 graden Celsius. Verwijder de oligonucleotidemix uit de PCR-machine en laat deze afkoelen bij kamertemperatuur. Om de pX330-xCas9 vector te verteren, met Bbs1, combineer de vector, enzym en spijsvertering buffer in een 50 microliter volume en broeden de reactie op 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Na het uitvoeren van celtransformatie, kies vijf tot 10 bacteriële kolonies uit de LB-plaat en gebruik elk van hen om een milliliter LB-media in te enten met 60 milligram ampicilline in een buis van 1,5 milliliter. Vervolgens broeden de buizen op een roterende shaker voor twee tot drie uur. Voer PCR uit om te screenen op recombinant plasmiden zoals beschreven in het tekstmanuscript en voer de producten uit op een 2%Agarose gel onder 10 volt per centimeter.

Na het identificeren van de positieve plasmiden, gebruik ze, samen met een reporter vector, om samen een geschikte cellijn te transfecteren. Om de cellen lyse, verwijder het groeimedium uit de gekweekte cellen. Was het oppervlak van het kweekvat voorzichtig met PBS en doe 100 microliter PLB in elke cultuur goed af om de celmonolaag volledig te bedekken.

Laat de plaat 20 minuten op kamertemperatuur uitbroeden en breng het lysaat vervolgens over op een buis of flesje voor verdere behandeling of opslag. Om de dubbele luciferase test uit te voeren, programmeer de luminometers om een twee seconden pre-read vertraging te bieden, gevolgd door een meetperiode van 10 seconden. Dan, afzien van 100 microliter luciferase assay reagens in het juiste aantal luminometerbuizen.

Voeg voorzichtig 20 microliter cellysaat toe aan de luminometerbuis en meng door twee of drie keer te pipetten. Plaats de buis in de luminometer en start de meting. Verwijder de monsterbuis van de luminometer.

Voeg 100 microliter stop reagens en vortex kort toe om te mengen. Breng het monster terug naar de luminometer en start met meten. Neem de Renilla Luciferase activiteit, genormaliseerd naar de Firefly Luciferase activiteit, met name de wederkerigheid van de verhouding weergegeven op het scherm.

Gooi de reactiebuis weg als deze klaar is. Deze methode werd gebruikt om drie sgRNA vectoren voor schapen DKK2 Exon 1 te genereren. sgRNA en xCas9 uitdrukken vectoren werden gebouwd door pre-verteren van de vector ruggengraat, gevolgd door het ligating in een reeks van korte, dubbele streng DNA fragmenten door middel van annealing oligo paren.

Zeven bacteriële kolonies werden gescreend met specifieke primer paar geleide PCR en de positieve kolonies werden gedetecteerd. Het gen gericht op capaciteiten van pX330-xCas9 T1, T2 en T3 werden gelijktijdig gedetecteerd met de dubbele luciferase test. De laatste sgRNA vector toonde het hoogste detectiesignaal en werd vervolgens gebruikt voor schapengenonderzoek.

Volgens dit protocol kan een T7EI-test of een Ribonuclease-test worden uitgevoerd. Deze aanvullende maatregelen geven nauwkeurigere indrukken van endogene genen bewerken.