Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

mRNA-elektroporatie zorgt voor een snelle, efficiënte en ruimtelijk en tijdelijk gecontroleerde expressie van meerdere eiwitten binnen het vogelmodelsysteem. Deze methode zorgt voor een bredere en snellere expressie van fluorescerende eiwitten dan de etikettering bereikt door standaard DNA-elektroporatie. Elektroporatie vergemakkelijkt de tijdelijke opening van poriën in het plasmamembraan die dienen als leidingen voor de overdracht van genetische ladingen zoals RNA en DNA in de cellen van talrijke modelorganismen.

Voor de eerste experimenten werken met embryo's die ouder zijn dan een dag oud, omdat ze sterker en beter bestand zijn tegen externe manipulaties zoals elektroporatie. In het juiste embryonale ontwikkelingsstadium breek en giet de kwarteleiinhoud in een 10 centimeter Petrischaal. Gebruik een transferpipet om het grootste deel van het dikke album te verwijderen.

Gebruik een laboratoriumweefsel om het oppervlak van het juk voorzichtig af te vegen om het resterende dikke albumen rond het embryo te verwijderen om ervoor te zorgen dat het embryo stevig aan de papieren ring blijft plakken. Leg voorgesneden filterpapier over het embryo en gebruik een schaar om soepel rond de omtrek van het embryo te snijden. Gebruik een Pasteur pipet om PPS laag onder het embryo met behulp van zachte stromen om een juk vasthouden aan het weefsel te verlaten.

Trek langzaam de embryopapierring onder een schuine hoek omhoog en af van het juk. Plaats het papier in een petrischaal gevuld met PBS voor verdere reiniging. Zodra het grootste deel van het juk is verwijderd, plaats de embryo ventrale kant omhoog in een 35 millimeter Petri schotel bedekt met een halfsolid mengsel van agar en albumen.

Bereid de elektroporatiekamer voor door de zwarte elektrode aan te sluiten die deze vult met PBS en het embryo erin plaatst. Gebruik een glazen microcapillair om een bolus van 200 nanoliters mRNA in de holte tussen het epiblast en vitelline membraan te injecteren dat het gewenste gebied bedekt. En gebruik dan de rode elektrode om het embryo te elektroreren.

Plaats het geëlektreerde embryo terug op het agar-albumen mengsel en incubaal op 38 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase. Voor beeldvorming van de elektroporatie-gecodeerde fluorescerende eiwitten observeren alle geëlektrooeerde embryo's onder een fluorescerende ontleden stereoscoop om de gezondste en beste elektrogepoed embryo voor de dynamische imaging experimenten te selecteren. Blijf de andere geëlektrificeerde embryo's en niet-geëlektrificeerde embryo's in een aparte couveuse uitbroeden.

Spoel het geselecteerde embryo kort af met PBS om eventuele bellen te verwijderen die zich tijdens de elektroporatie aan de rugzijde van het embryo kunnen hebben gevormd. Plaats het gereinigde embryo direct in een beeldvormingsschotel met een dunne laag van ongeveer 150 microliter albumen-agar die ervoor zorgt dat er geen bellen op het dorsale oppervlak van het embryo worden gegenereerd. Voeg een klein vochtig opgerold stuk tissuepapier langs de binnenranden van de beeldvorming schotel.

Verzegel de schotel met paraffinefolie om verdamping tijdens de beeldvorming en incubatie te minimaliseren. Verplaats de schotel snel naar de voorverwarmde fase van een confocale microscoop en gebruik het brightfield kanaal om de gekleurde kleurstof in het embryo te lokaliseren. Stel de beeldsoftware op het gewenste doel, dichroic spiegel, en emissie spectra, en zet een geschikte laser.

Zorg ervoor dat de cellen blijven in het beeld visie voor het geheel van de film. Gebruik een hoog genoeg beeldresolutie en zorg ervoor dat de beeldvormingscondities geen fototoxiciteit veroorzaken. Klik op Live in de beeldsoftware en pas de laserkracht aan op een instelling die geschikt is voor de fluorescentieintensiteit, afhankelijk van elke laserkracht van de microscoop.

Begin met het imaging van het embryo met behulp van 1%laservermogen en een 800-winst, waardoor de laserkracht langzaam met 1% wordt verhoogd totdat verzadigde pixels worden gezien. Wanneer verzadigde pixels worden waargenomen, neemt het laservermogen iets af totdat er geen verzadigde pixels kunnen worden gevisualiseerd. Beeld het embryo om de drie tot vijf minuten om de migratie van individuele cellen over verschillende tijdspunten te controleren met behulp van vijf micrometer Z-stacks van het gehele geëlektrificeerde gebied met wat extra ruimte naar de onderkant van de Z-stack in het geval het embryo tijdens de beeldvormingssessie in het agarosebed zinkt.

Om te zien hoe snel de cellen bewegen controleer de eerste paar keerpunten van de eerste film. Als de cellen snel bewegen, u overwegen de zoom van het afgebeelde gebied uit te breiden of een andere regio te beelden. Wanneer het hele geëlektrificeerde gebied van het embryo is afgebeeld, beeld in niet-geëlektrroplateerd gebied van hetzelfde embryo om de autofluorescentie niveaus te bepalen.

Om te bepalen hoe lang doorfected mRNA kan worden vertaald in fluorescerende eiwitten na bevestiging van elektroporatie van het gen van belang op de stereomicroscoop, plaats het embryo op een voorverwarmd stadium van de omgekeerde confocale microscoop en gebruik de 405 nanometer laser met een 70%laservermogen, 100 iteraties, en een scansnelheid van vier om het grootste deel van de cellulaire fluorescentie van het geëlektrificeerde gen op verschillende tijdstippen te fotobleach. Blijf de embryo's op het podium uitbroeden bij 36 graden Celsius na fotobleken, waarbij u aandacht besteedt aan de actief delende cellen binnen het gefotobleekte gebied dat doorgaans alleen in gezonde embryo's wordt gezien en dus erop wijst dat de elektroporatie de embryonale cellen niet schaadde. Verkrijg post-bleekste Z-stack beelden van het geëlektrificeerde gebied voor een gewenste tijdsduur bij regelmatige tijdsintervallen van drie tot vijf minuten.

Om ervoor te zorgen dat de beeldvormingscondities de overleving van het embryo niet schadelijk beïnvloeden, worden gelijktijdig geëlektrificeerde embryo's geïncedeerd die niet worden gefotobleekt om te dienen als controle voor de beeldvorming. Om de fotobleaching resultaten voor het mRNA verval post-elektroporatie te kwantificeren gebruik ImageJ om de fluorescentie intensiteit van een 7,5 micrometer cirkel in het midden van het geëlektroopte gebied van elke cel te meten om de cel fluorescentie te volgen over elk interval van drie tot vijf minuten. Wanneer alle cellen binnen het gefotobleekte gebied dat geen mitose ondergaan en volledig gefotobleached zijn gemeten, plot de fluorescentie intensiteit na verloop van tijd post-bleekmiddel op elk van de tijd punten van het embryo werd fotobleached.

Hoewel DNA-elektroporatie leidt tot een helderdere fluorescentie in sommige geëlektrificeerde cellen, is de efficiëntie van DNA-elektroporatie zichtbaar lager in vergelijking met de breed uitgedrukte mRNA-gecodeerde fluorescerende eiwitten. Bij het vergelijken van DNA en mRNA co-elektroporatie binnen hetzelfde embryo, is het DNA dat fluorescerende eiwitefficiëntie uitdrukt ook aanzienlijk en consequent minder efficiënt dan dat van het mRNA dat fluorescerend eiwit uitdrukt. Kwantificering van alle embryo's geëlektroplateerd met alleen mRNA, DNA of een combinatie van de twee, blijkt dat mRNA transfects ongeveer 75% van de cellen in een bepaald gebied, terwijl DNA slechts transfects ongeveer 25% van de cellen.

Het transfected mRNA moet leiden tot een snellere eiwitproductie in vergelijking met transfected DNA, omdat het mRNA onmiddellijk kan worden herkend door cytosolische vertaalmachines. Hoewel de co-elektroporatie van meerdere NC's eerder relatief inefficiënt bleek te zijn, resulteerde de co-elektroporatie van vier mRNAs in dit experiment in een transfectie-efficiëntie van 87% van alle vier de mRNAs binnen alle geëlektrificeerde gebieden. Hoewel fotobleaching in eerste instantie vermindert de fluorescentie intensiteit in de gefotobleached cellen met ongeveer 95%sommige cellen blijven die hun vermogen om te verdelen en uit te drukken fluorescerende eiwitten kort na elektroporatie te herstellen.

Deze capaciteit vermindert meer dan vijf uren post-elektroporatie nochtans. Neem de tijd het optimaliseren van de beste beeldvorming voorwaarden en blijven sleutelen, zelfs na het starten van de film klaar om eventuele aanpassingen te maken indien nodig.