Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

Het influenzaantige microarray maakt het mogelijk om meerdere antilichaam-isotypen gelijktijdig te meten tegen meer dan 300 influenzastammen uit een klein bloedmonstervolume van slechts één microliter. De microarray vergemakkelijkt een hoge doorvoermeting van de breedte van de influenzaantilichamen in het antigene landschap van influenzastammen. Door influenzaantilichamen in meer detail te karakteriseren dan voorheen mogelijk was, kan deze microarray helpen bepalen waarom bepaalde mensen een influenza-infectie ontwikkelen en anderen niet.

De antigeenmicroarraytechniek is toegepast op 35 verschillende ziekteverwekkers in ons laboratorium, waardoor antilichamen kunnen worden gemeten tegen 60.000 antigeendoelen en van 50.000 serummonsters verzameld uit infectieziekten en gezonde controles wereldwijd. Na deze techniek te hebben onderwezen door middel van persoonlijke workshops, hebben we ontdekt dat het visueel kunnen aantonen van de techniek cruciaal is voor het begrip en de prestaties ervan. Het aantonen van de procedure zal Al Jasinskas en Rafael De Assis, projectwetenschappers van ons laboratorium.

Als u antigenen wilt afdrukken met behulp van een microarrayprinter, selecteert u een printer met microarrayspotpen met een laag volume die de antigenen van een 384-bronplaat in het monsterkanaal kunnen aanzuigen en de antigenen via direct contact en capillaire actie kunnen deponeren op 16 pad nitrocellulose gecoate glasplaten. Voer in de afdruksoftware het aantal monsterplaten in dat wordt gebruikt in het tekstvak nummerplaten en selecteer het plaattype dat voor de analyse wordt gebruikt. Selecteer een pinconfiguratie en stel de oorsprongsverschuivingen in op de afstanden tussen de oorsprong van de dia en de locatie waar de afdrukpennen op de dia's worden afgedrukt.

Definieer onder het tabblad arrayontwerp de grootte en vorm van de arrays en selecteer de parameters voor hoe de afdrukpennen de voorbeelden oppakken en afgeven. Configureer de pinreinigings- en blottingprotocollen en definieer de volgorde waarin de voorbeeldblokken op de dia's worden afgedrukt. De arraysoftware zal een geannoteerd rasterindexbestand construeren om de rangschikking van antigenen binnen elke microarray te beschrijven.

Nadat u de afdruksoftware met het gewenste protocol hebt geprogrammeerd, start u de afdrukrun. Wanneer voltooid, plaats unprobed microarray dia's in een lichtdichte doos in een desiccator kast op kamertemperatuur. Om sera te sonde voor antilichamen op de microarray, gebruik clips om de microarray dia's pad kant hechten op de indringende kamers en plaats de kamers in de frames.

Wees voorzichtig bij het monteren van de dia's, omdat ze gemakkelijk zijn gebroken en controleren op eventuele lekkage na rehydratatie. Indien nodig, demonteren en opnieuw monteren van de dia's om lekken op te lossen. Rehydrateer de dia's met 100 microliters gefilterde blokkeringsbuffer per put en verdun de sera met een verhouding van één tot 100 in 100 microliters van blokkeringsbuffer per monster.

Vervolgens, incubeer de gerehydrateerde microarray dia's en de verdunde sera gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 100 tot 250 rotaties per minuut op een orbitale shaker. Gebruik aan het einde van de incubatiepijptips die zijn aangesloten op een vacuümlijn met een secundaire verzamelkolf om de blokkeerbuffer vanuit de hoek van elke kamer zorgvuldig aan te trekken zonder de pads aan te raken en voeg onmiddellijk de verdunde sera toe aan de pads zonder dat de pads kunnen drogen. Plaats vervolgens de bedekte frames in trays met vochtige papieren handdoeken verzegeld om de luchtvochtigheid te behouden en de frames 's nachts in te broeden op vier graden Celsius op een schommelende shaker.

Voor quantum dot geconjugeerde secundaire antilichaam etikettering, zorgvuldig aspirate de sera zoals net aangetoond en spoel de dia's met drie wasbeurten in 100 microliters van verse TTBS buffer per goed gedurende vijf minuten elk op een orbitale shaker. De dia's worden vervolgens geïncubeerd met een mengsel van quantum dot geconjugeerde secundaire antilichamen en vervolgens drie keer gewassen zoals beschreven in het protocol, met behulp van dezelfde techniek als net aangetoond. Verwijder na de laatste wasbeurt voorzichtig de glijbanen uit de kamers en spoel de glijbanen voorzichtig af met gefilterd dubbel gedestilleerd water en plaats elke glijbaan in een buis van 50 milliliter.

Droog vervolgens de glijbanen door centrifugatie. Om beelden van de microarray-dia's te verkrijgen, schakelt u eerst de draagbare imager in en plaatst u de dia voorzichtig met het gezicht naar beneden in de schuifhouder in de beeldkamer. Open de beeldsoftware en selecteer onder het tabblad afbeeldingsafbeeldingen configureren de juiste diaconfiguratie.

Selecteer onder het tabblad afbeeldingsbesturingselement het juiste tl-kanaal en pas de belichtings- en acquisitietijden aan, afhankelijk van de reactiviteit van de sera. Klik vervolgens op vastleggen om de afbeeldingsverwerving te starten. Gebruik aan het einde van de overname de rasters die op de fiduciale markeringen zijn georiënteerd om de arrayspots te detecteren.

Als u de spotintensiteit wilt meten, uploadt u in het deelvenster bestandsinfo het galbestand en geeft u de map op waar de analyse-uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen in de sectie analyseopties. Open onder het tabblad afbeeldingsbesturingselement een van de verkregen afbeeldingen die moeten worden gekwantificeerd en selecteer automatisch. Maak in de sectie arrayanalyse een fiduciale sjabloon zoals geïnstrueerd door de software.

Klik op batchanalyse om de map te selecteren die de afbeeldingen bevat die moeten worden gekwantificeerd en selecteer de fiduciale sjabloon die zojuist is gemaakt. De software analyseert elk beeld en kwantificeert de spotintensiteit. Analyseer vervolgens de ruwe gegevens om de antilichaambinding tussen antigenen en tussen serummonsters te vergelijken.

In deze representatieve studie, de secundaire antilichamen gebruikt waren Goat Anti-Human IgG vervoegd om quantum dot uitzenden op 800 nanometer en Goat Anti-Human IgA vervoegd om quantum dot uitzenden op 585 nanometer voor multiplex detectie van IgG en IgA antilichamen respectievelijk. In de resulterende heat map, alleen de klinisch relevante subtypes met een hoge vertegenwoordiging werden gelabeld om ruimte te besparen met het plusteken dat alle resterende subtypes van een hoger getal aanduidt. Serum IgA en IgG werden gegroepeerd door hun hemagglutinine en neuraminidase moleculaire vormen en subtypes.

Om de hoge specificiteit van de hemagglutinine hoofdgroep antilichamen voor de klinische subtypes en de hoge kruisreactiviteit van hele hemagglutinine en getriameriseerde hele hemagglutinine antilichamen met de opname van de voorraad regio aan te tonen. Influenza antilichaam reacties gemeten op de microarray kan worden bevestigd door traditionele technieken, met inbegrip van hemagglutinatie remming en microneutralisatie testen. Deze techniek heeft inzicht gegeven in de subtypespecificiteit van antilichamen tegen de influenzahoofdgroep en het relatieve belang van IgA- en IgG-antilichamen tegen influenzagevoeligheid.

Hoewel geen van de materialen uiterst gevaarlijk is, moeten alle menselijke serummonsters worden behandeld volgens de institutionele bioveiligheidsprotocollen.