Name: Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer multiplexed single cell mRNA-sequencing voor genexpressieprofilering in embryonale weefsels van de muis. Deze druppelgebaseerde methode vermindert kosten en minimaliseert batch-effecten bij transcriptoomanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken David M. Patterson en Christopher S. McGinnis van Dr. Zev J. Gartner Lab voor hun vriendelijke aanbod van de op lipide gebaseerde barcoderende reagentia en suggesties voor de experimentele stappen en data-analyse. Dit werk werd opgericht door de National Institutes of Health (HL13347202).

<ol><li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877(2008).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377(2009).</li>
<li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476(2019).</li>
<li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100(2017).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175(2016).</li>
<li>Grün, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77(2016).</li>
<li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).</li>
<li>SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).</li>
<li>Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).</li>
<li>Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).</li>
<li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li>
<li>Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

In deze studie hebben we een protocol getoond om transcriptionele profielen van één cel te analyseren. We hebben ook twee optionele methoden beschikbaar gesteld voor het multiplex van samples in de scRNA-SEQ-workflow. Beide methoden zijn haalbaar gebleken bij verschillende laboratoria en aangeboden oplossingen voor het uitvoeren van een kostenbesparend en batch-effect-vrije eencellige experiment18,26.
Er zijn een paar stappen die zorgv...

Het transcriptionele profiel van elke afzonderlijke cel varieert tussen de celpopulaties tijdens de embryonale ontwikkeling. Hoewel enkelvoudige moleculaire in-situ hybridisatie kan worden gebruikt om de uitdrukking van een klein aantal genen1te visualiseren, biedt een enkelvoudige cel mRNA-sequencing (Scrna-SEQ) een onpartijdige benadering om genoom-brede expressie patronen van genen in afzonderlijke cellen te illustreren. Nadat het voor het eerst werd gepubliceerd in 20092, is scrna-SEQ toegepast om meerdere weefsels te bestuderen in meerdere ontwikkelingsstadia in de laatste jaren3,4,5. Ook, omdat de Human Cell Atlas onlangs zijn ontwikkelingsgerichte projecten heeft gelanceerd, worden er in de nabije toekomst meer enkelvoudige celgegevens van menselijke embryonale weefsels naar verwachting gegenereerd.
Het hart als het eerste orgel om te ontwikkelen speelt een cruciale rol in de embryonale ontwikkeling. Het hart bestaat uit meerdere celtypen en de ontwikkeling van elk celtype is strak gereguleerd, tijdelijk en ruimtelijk. In de afgelopen jaren, de oorsprong en celafstamming van cardiale cellen in vroege ontwikkelingsstadia zijn gekenmerkt6, die bieden een enorme nuttige navigatie tool voor het begrijpen van aangeboren hart-en vaatziekten pathogenese, evenals voor het ontwikkelen van meer technologisch geavanceerde methoden te stimuleren hartspier regeneratie7.
De scrna-SEQ heeft de laatste jaren8,9,10een snelle expansie ondergaan. Met de nieuw ontwikkelde methodes is het ontwerp en de analyse van eencellige experimenten meer haalbaar geworden11,12,13,14. De hier gepresenteerde methode is een commerciële procedure gebaseerd op de druppel oplossingen (Zie tabel met materialen)15,16. Deze methode is voorzien van het vastleggen van cellen en sets van unieke met kralen in een olie-water emulsie druppel onder controle van een microfluïdisch controller systeem. De snelheid van het laden van cellen in de druppels is extreem laag, zodat de meerderheid van de druppel emulsies slechts één cel17bevatten. Het ingenieuze ontwerp van de procedure komt van scheiding van één cel tot druppel emulsies die gelijktijdig met barcoding plaatsvinden, waardoor de parallelle analyse van afzonderlijke cellen met behulp van RNA-SEQ op een heterogene populatie mogelijk is.
De integratie van multiplexing strategieën is een van de belangrijke toevoegingen aan de traditionele single cell workflow13,14. Deze toevoeging is zeer nuttig bij het verwijderen van celdubbeltjes, het reduceren van experimentele kosten en het elimineren van batch-effecten18,19. Een lipide-gebaseerde barcoding strategie en een antilichaam gebaseerde barcoding strategie (Zie tabel van de materialen) zijn de twee meest gebruikte multiplexing methoden. Specifieke streepjescodes worden gebruikt om elk monster in beide methoden te labelen, en de gelabelde voorbeelden worden vervolgens gemengd voor het vastleggen van één cel, het voorbereiden van bibliotheken en sequentiëren. Daarna kunnen de verzamelde sequentie gegevens worden gescheiden door de barcode sequenties te analyseren (Figuur 1)19. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen de twee methoden. De lipide-gebaseerde barcoding strategie is gebaseerd op lipide-gemodificeerde oligonucleotiden, die niet is gebleken dat een voorkeuren voor het celtype. Terwijl de op antilichamen gebaseerde barcoderende strategie alleen de cellen kan detecteren die de antigeen-eiwitten19,20uitdrukken. Bovendien duurt het ongeveer 10 minuten om de lipiden te vlekken, maar 40 min om de antilichamen te vlekken (Figuur 1). Bovendien zijn de lipide-gemodificeerde oligonucleotiden goedkoper dan antilichamen-geconjugeerde oligonucleotiden, maar niet commercieel beschikbaar op het moment van schrijven van dit artikel. Tot slot, de lipide-gebaseerde strategie kan multiplex 96 monsters in één experiment, maar de antilichaam gebaseerde strategie kan momenteel alleen multiplex 12 monsters.
Het aanbevolen celnummer voor multiplex in een enkel experiment moet lager zijn dan 2,5 x 104, anders zal het leiden tot een hoog percentage van celdubbeltjes en potentiële omgevings-mRNA besmetting. Door middel van de multiplexing strategieën, de kosten van het vastleggen van één cel, cDNA generatie en bibliotheek voorbereiding voor meerdere monsters worden gereduceerd tot de kosten van één steekproef, maar de sequentiëren kosten blijft hetzelfde.

<table><tbody><tr><td>10% Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Chip Holder</td><td>10x Genomics</td><td>120252 330019</td><td></td></tr><tr><td>10x Chromium Controller</td><td>10x Genomics</td><td>120223</td><td></td></tr><tr><td>10x Magnetic Separator</td><td>10x Genomics</td><td>120250 230003</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex Adapter</td><td>10x Genomics</td><td>330002, 120251</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex Clip</td><td>10x Genomics</td><td>120253 230002</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td></tr><tr><td>Barcode Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Single-stranded DNA</td><td>25 nmol</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Chales River</td><td>Strain Code 022</td><td>ordered pregnant mice</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Appendorf</td><td>2231000214</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000073</td><td>Store at ambient temperature</td></tr><tr><td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>120262</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000094</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' Library Kit v3</td><td>10x Genomics</td><td>1000095</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads</td><td>10x Genomics</td><td>2000059</td><td>Store at -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma/Millipore</td><td>10103578001</td><td>Store powder at 4 &deg;C, store at -20 &deg;C after it dissolves</td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Sigma/Millipore</td><td>11088807001</td><td>Store powder at 4 &deg;C, store at -20 &deg;C after it dissolves</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431048</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>2000048</td><td>Store at 4 &deg;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Theromo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&mu;l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661020N</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&mu;l</td><td>Theromo Scientific</td><td>4661000N</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi Cell Strainer</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td>Porosity 40 &mu;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td></tr><tr><td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td>Add 5 &micro;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &micro;l staining volume</td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0295239</td><td>Store at -20 &deg;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td></tr><tr><td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Single-stranded DNA</td><td>100 nmol</td></tr><tr><td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950W</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &amp; magnesium</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 4-pack (0.1&ndash;2.5&mu;L, 0.5-10&mu;L, 10&ndash;100&mu;L, 100&ndash;1,000&mu;L variable-volume pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318 (60ml)</td><td></td></tr><tr><td>Template Switch Oligo</td><td>10x Genomics</td><td>3000228</td><td>Store at -20 &deg;C, used in Master Mix (Table 1)</td></tr><tr><td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The cell browser is Loup Cell Browser</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td></tr><tr><td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td><td>10x Genomics</td><td></td><td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target

multiplexed single cell mrna sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Enkelvoudige cel mRNA-sequencing heeft in de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt en is uitgegroeid tot een belangrijk instrument op het gebied van ontwikkelingsbiologie. Het is met succes gebruikt om zeldzame celpopulaties te identificeren, nieuwe marker genen te ontdekken en ruimtelijke en temporele ontwikkelings informatie te decoderen. De methode met één cel is ook geëvolueerd van de microfluïdische gebaseerde Fluidigm C1-technologie naar de droplet-gebaseerde oplossingen in de laatste twee tot drie jaar. Hier gebruikten we het hart als een voorbeeld om te laten zien hoe de muis embryonale weefselcellen te profiel met behulp van de druppel gebaseerde scRNA-SEQ methode. Daarnaast hebben we twee strategieën geïntegreerd in de workflow voor het profiel van meerdere samples in één experiment. Met behulp van een van de geïntegreerde methoden, hebben we gelijktijdig meer dan 9.000 cellen geprofileerd uit acht hart monsters. Deze methoden zullen waardevol zijn voor het ontwikkelingsbiologie veld door een kosteneffectieve manier te bieden om afzonderlijke cellen tegelijkertijd te Profiel van verschillende genetische achtergronden, ontwikkelingsstadia of anatomische locaties.

In deze studie gebruikten we de muis embryonale hart als een voorbeeld om te exposeren hoe Multiplexed single cell mRNA sequencing werd uitgevoerd om de verschillende monsters uit afzonderlijke delen van een orgaan tegelijkertijd te verwerken. E 18.5 CD1 muis harten werden geïsoleerd en ontleed in linker Atrium (LA), rechter Atrium (RA), linker ventrikel (LV) en rechter ventrikel (RV). De atriale en ventriculaire cellen werden vervolgens onafhankelijk van elkaar met behulp van een op lipi...

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Single cell mRNA sequencing wordt veel gebruikt om de biologische processen op een eencellig niveau te begrijpen. De komst van multiplexing strategieën heeft verder uitgebreid zijn versterkingen door het toestaan van de profilering van meerdere monsters in een enkel experiment, drastisch verminderen van de kosten en het vermijden van de batch-effecten. Het aantonen van de procedure zal Wei Feng, een postdoc, en Andrew Przysinda, een technicus van mijn lab.Na het tellen, splits de cellen geïsoleerd van embryonale dag 18,5 hartkamers in vijf keer 10 tot de vijfde aliquots en was de cellen twee keer met verse PBS per wasbeurt. Resuspend de pellets in 180 microliter PBS per monster en voeg 20 microliter anker barcode voorraad oplossing aan elke buis met zachte mengen. Na een vijf minuten durende incubatie op ijs, voeg 20 microliter van co-anker barcode voorraad oplossing aan elke buis met zachte mengen voor een extra vijf minuten incubatie op ijs voor het wassen van de cellen drie keer met een milliliter koude PBS aangevuld met 1%runder serum albumine per wasbeurt, dan filteren de monsters in nieuwe buizen door middel van een 40-micrometer cel s per buistrainer.Na het tellen, monteren

multiplexed-single-cell-mrna-sequencing-analysis-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Leer multiplexed single cell mRNA-sequencing voor genexpressieprofilering in embryonale weefsels van de muis. Deze druppelgebaseerde methode vermindert kosten en minimaliseert batch-effecten bij transcriptoomanalyse.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Meer video's verkennen