Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Single cell mRNA sequencing wordt veel gebruikt om de biologische processen op een eencellig niveau te begrijpen. De komst van multiplexing strategieën heeft verder uitgebreid zijn versterkingen door het toestaan van de profilering van meerdere monsters in een enkel experiment, drastisch verminderen van de kosten en het vermijden van de batch-effecten. Het aantonen van de procedure zal Wei Feng, een postdoc, en Andrew Przysinda, een technicus van mijn lab.

Na het tellen, splits de cellen geïsoleerd van embryonale dag 18,5 hartkamers in vijf keer 10 tot de vijfde aliquots en was de cellen twee keer met verse PBS per wasbeurt. Resuspend de pellets in 180 microliter PBS per monster en voeg 20 microliter anker barcode voorraad oplossing aan elke buis met zachte mengen. Na een vijf minuten durende incubatie op ijs, voeg 20 microliter van co-anker barcode voorraad oplossing aan elke buis met zachte mengen voor een extra vijf minuten incubatie op ijs voor het wassen van de cellen drie keer met een milliliter koude PBS aangevuld met 1%runder serum albumine per wasbeurt, dan filteren de monsters in nieuwe buizen door middel van een 40-micrometer cel s per buistrainer.

Na het tellen, monteren chip B in een chiphouder, voeg dan 75 microliters van een 50%glycerol oplossing om de ongebruikte putten in rij een, 40 microliters aan de ongebruikte putten in rij twee, en 280 microliters aan de ongebruikte putten in rij drie. Houd er rekening mee dat hier een trainingschip wordt gebruikt om de procedure aan te tonen. Voeg het juiste volume van celsuspensie en nuclease-vrij water toe aan de mastermix met zachte pipetting.

Voeg 75 microliter van de resulterende celoplossing toe aan het onderste midden van het monster, goed in rij, zonder bubbels. Vortex de gel kralen voor 30 seconden voordat langzaam toe te voegen 40 microliter kralen aan het onderste midden van de gel kraal goed in rij twee zonder bubbels. Voeg 280 microliters van het verdelen van olie in de zijwand van de scheidingsolie goed in rij drie.

Bevestig de pakking aan de chip zonder op de pakking te drukken en houd de pakking horizontaal om bevochtiging van de pakking te voorkomen. Laad de geassembleerde chip met de pakking in de chroomregelaar en voer het chromium single cell B-programma uit. Merk op dat het scherm chromium training voor de training chip toont, maar voor de echte experimenten het scherm zal chroom eencellige B.When het programma is voltooid, onmiddellijk verwijderen van de chip en gooi de pakking.

Vouw het deksel terug om de putten bloot te leggen onder een hoek van 45 graden en controleer de vloeistofniveaus om ervoor te zorgen dat er geen klompen aanwezig zijn. Langzaam 100 microliter gelkralen in emulsie uit de laagste punten van de herstelput aanzuigen en de uniformiteit van de kralen controleren. Doe de geëmulgeerde kralen langs de muur van een nieuwe PCR-buis op ijs en plaats de buis in een thermische cycler voor omgekeerde transcriptie.

Om de cDNA voor te bereiden op versterking, voeg 125 microliter van herstelmiddel toe aan het monster bij kamertemperatuur. Er mag geen ondoorzichtige vloeistof worden waargenomen en voorkomen dat pipetting of vortexing. Wacht 60 seconden voordat u het herstelmiddel langzaam van de onderkant van de buis verwijdert en voeg 200 microliter vortexkraal opschonen mengsel aan het monster.

Pipette het mengsel 10 keer voor het uitbroeden gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats vervolgens de monsters op een magneet in de hoge positie. Wanneer de oplossing wist, verwijder de supernatant en voeg 200 microliter van 80% ethanol aan de pellet.

Na 30 seconden, verwijder de ethanol en herhaal de was nog twee keer. Na de laatste wasbeurt, kort centrifugeren het monster en plaats de buis op de magneet in de lage positie om het monster te drogen voor minder dan twee minuten. Wanneer het monster is gedroogd, verwijder de buis uit de magneet en voeg 35,5 microliter vers bereide elutieoplossing toe.

Na een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur, plaatst u het monster op de magneet in de hoge positie totdat de oplossing wist voordat u 35 microliter van het monster naar een nieuwe buisstrip overzet. Voor cDNA-versterking met behulp van de op lipide gebaseerde barcoding-strategie, voeg versterking reactie mengsel aan de 35-microliter cDNA monsters met een grondige mengen voordat kort centrifugeren. Aan het einde van de spin, incuberen het monster in de thermische cycler na de juiste cDNA versterking procedure.

Voeg 120 microliter van geselecteerde reagens en 100 microliter ultrazuiver water toe aan 100 microliter monster en pipet het resulterende 0,6x select reagens 15 keer. Na een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, plaats het monster op de magneet totdat de oplossing duidelijk wordt. Breng de supernatant over naar een 1,5 milliliter lage bindbuis voor multiplexing barcoded cDNA bibliotheekconstructie.

Vergeet niet om zowel de supernatants en de basis op te slaan als de inhoud van de supernatant barcoded cDNA en de basisinhoud endogene cDNA assembleren. Reinig de endogene cDNA met 80% ethanol en ontwijk het DNA met 40 microliters elutiebuffer, voer vervolgens een kwaliteitscontrole uit van de endogene cDNA voordat u een endogene transcriptiebibliotheek voorbereidt. De cDNA-concentratie moet vóór de bouw van de bibliotheek worden gekwantificeerd en gekwalificeerd.

De gebouwde bibliotheken, met inbegrip van de endogene cDNA- en barcodebibliotheken, moeten ook worden gekwantificeerd en gekwalificeerd voordat ze worden gesequenced. Na sequencing kan de streepjescodeexpressie in elke cel worden geanalyseerd. In deze analyse werden bijvoorbeeld acht groepen enkele cellen waargenomen die op unieke wijze één type streepjescode uitgaven dat cellen uit acht verschillende monsters vertegenwoordigt.

Bovendien drukten sommige cellen geen streepjescode uit en werden daarom gedefinieerd als negatieve cellen, terwijl andere cellen twee verschillende barcodes uitdrukten die doubletten vertegenwoordigen. Met behulp van de singlet cellen, de cellulaire heterogeniteit en moleculaire regelgeving kunnen worden beoordeeld door cel type annotatie, nieuwe en zeldzame cel type identificatie, anatomische zone vergelijkende analyse, en gen ontologie traject analyse, zoals celcyclus fase scheidingen. Het is nuttig om beeld van de gel kralen in emulsie als je, als een afbeelding zal u vertellen of de procedure succesvol is geweest tot op dit punt.

De sample multiplexing voegt een grote flexibiliteit toe bij het ontwerpen van uw experimenten. Na het bekijken van deze demonstratie, hoop ik dat u meer vertrouwen over het starten van uw eigen experimenten.