Het combineren van fluidic devices met microscopie en flow cytometrie om microbiële transporten te bestuderen in poreuze media over ruimtelijke schalen

Het bestuderen van het transport van bacteriën in poreuze systemen is belangrijk met betrekking tot besmetting, verspreiding van ziekten en bioremediatie. Voor deze experimenten in wiskundige modellen die op de eencellige, de bevolking en de microbiële gemeenschap niveau nodig zijn. Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van microfluïde apparaten en microscopie, evenals grotere apparaten in combinatie met stroomcytometrie.

De combinatie van microfluïde apparaten met microscopie en stroomcytometrie biedt een scala aan mogelijkheden om bacteriële transportverschijnselen op verschillende ruimtelijke schalen te bestuderen. Om dit protocol volledig te verkennen, wordt voorgesteld om eerdere ervaring te hebben in microscopie, basisbeeldverwerking, het ontwerpen van microfluïde apparaten en het beheersen van flow cytometrie. Deze video beschrijft twee methoden om bacterieel transport op verschillende ruimtelijke schalen te bestuderen.

De eerste methode, gebaseerd op microfluidic apparaten, is gebaseerd op microscopie om individuele cellen te tellen. Dit systeem kan worden gebruikt om bacterieel transport te bestuderen over meerdere ruimtelijke schalen van de porie tot de gehele poreuze systeemschaal. De tweede methode, met behulp van grotere vloeibare apparaten gekoppeld aan een geautomatiseerde dispenser en flow cytometrie, kan worden gebruikt om bacteriële transport fenomeen te bestuderen op de schaal van hele poreuze systemen.

Dergelijke methoden kunnen ook worden ingezet in laboratoriumkolomstudies, evenals kleine veldonderzoeken. Om te beginnen ontwerp je de gewenste poreuze geometrie die bestaat uit een matrix van cirkels. Op basis van de gekozen geometrie, bereiden een mal met behulp van standaard SU-8 fotolithografie.

Bereid 50 gram PDMS door 90% elastomeer toe te voegen aan 10% van het uithardingsmiddel tot 90% elastomeer in gewicht in een schone wegwerpcontainer en meng de twee reagentia met een schoon gereedschap. Breng een vacuüm van 100 millibar gedurende 30 minuten aan om opgeloste lucht en bellen te verwijderen. Plaats de mal in een petrischaal en giet de PDMS op de mal op de gewenste hoogte tussen twee en vijf millimeter.

Bedek de petrischaal met een deksel en houd het op 60 graden Celsius voor ten minste vier uur. Laat het microfluïde apparaat daarna afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra het is afgekoeld, voorzichtig verwijderen van de gewenste portie PDMS met een scalpel.

Verzegel de onderkant van het PDMS-kanaal tijdelijk met tape. Met een puncher met een diameter van 0,5 millimeter doorboort je kanalen om een inlaat en een uitlaat te creëren. Verwijder de tape uit het PDMS-kanaal en plaats het kanaal met de poreuze kant naar boven.

Behandel de glazen schuif en PDMS oppervlakken met plasma voor ongeveer 45 seconden elk bij kamertemperatuur. Plaats het voorbehandelde PDMS-kanaal op de voorbehandelde glazen schuif en verwarm 30 minuten op een hete plaat op 100 graden Celsius, verwijder vervolgens het microfluïde apparaat van de hete plaat en koel het af tot kamertemperatuur. Breng vacuüm gedurende 30 minuten aan om lucht uit PDMS te verwijderen.

Gebruik voor de productie van de basis met de porieruimte een zeer nauwkeurige microfrezen om 0,5 millimeter uit de basis-PMMA-laag te verwijderen en een groef te frezen ter grootte van 1,1 bij 1,1 millimeter voor een rubberen O-ring. Boor twee schroefdraadgaten voor een inlaat en uitlaat in het bovenste deel van het vloeibare apparaat en 12 gaten voor schroeven. Dit dient als het deksel van het vloeibare apparaat.

Na het reinigen van de fluidic apparaat, schroef de basis en het deksel samen met behulp van de 12 schroefdraad gaten. Verwijder de microfluïde uit het vacuüm en plaats het op de microscoop fase. Gebruik de spuitpomp om het te verzadigen met beweeglijkheidsbuffer.

Met behulp van Brightfield-microscopie of fasecontrast past u de vergroting aan om afzonderlijke bacteriële cellen te visualiseren en zich te concentreren op het midden van het observatiekanaal. Schakel de lichtpadinstellingen over naar fluorescentiemicroscopie. Pas de scherpstelling aan door middel van een verschuiving en de camerabelichtingstijd om individuele bacteriële cellen op te lossen.

In dit geval 100 milliseconden. Steek vervolgens de inlaatbuizen in een twee milliliter buis met de bacteriële suspensie. Keer de pomprichting om en begin de suspensie terug te trekken met een stroomsnelheid van één microliter per minuut.

Scan de dwarsdoorsnede van het gehele observatiekanaal en opname elke minuut een beeld. Importeer afbeeldingen naar een gewenst softwareplatform. Neem de achtergrond op als het gemiddelde van de eerste beelden wanneer er geen deeltjes zijn opgenomen.

Trek de achtergrond van elke afbeelding af om cameraruis en optische aberratie te verwijderen. Snijd de afbeeldingen bij in een gebied waar u van belang bent. Identificeer een drempelwaarde die gelijk is aan de pixelintensiteit van de celfluorescentie, zodat waarden die groter zijn dan de drempel bacteriële cellen bevatten.

Gebruik afbeeldingsverwerking om de drempelwaarde van elke afbeelding af te trekken. Binarize de resulterende afbeelding, zodat bacteriële cellen nemen een waarde van een, terwijl de achtergrond neemt een waarde van nul. Verwijder pixelclusters met een gebied dat kleiner is dan de kleinste bacteriële celgrootte in pixels.

Som de binarized afbeelding op om het totale aantal pixels van de resterende clusters te verkrijgen. Verdeel het aantal pixels door de gemiddelde grootte van een bacteriële cel in pixels om een schatting van het aantal cellen te verkrijgen. Zet de tellingen om in concentratie in deeltjes per milliliter.

Om de concentratie van de geïnjecteerde bacteriële suspensie te identificeren, injecteer de bacteriële suspensie in het observatiekanaal van een schoon microfluïdisch apparaat met een spuit. Nota van de afbeelding en bereken de eerder getoonde bacteriële concentratie. Visualiseer baanbrekende rondingen door de effluent bacteriële concentratie C te normaliseren met de influent bacteriële concentratie C0 en C te plotten boven C0 versus tijd.

Om de lokale snelheden en trajecten van bacteriën die door de poreuze matrix worden getransporteerd te analyseren, verplaatst u het microscoopstadium naar een gebied van belang en past u de focus aan het midden van het microfluïde apparaat aan. Stel de optische configuratie in op fasecontrast- of fluorescentiemicroscopie. Neem time-lapse beelden en een belichtingstijd kort genoeg om bacteriële verplaatsing vast te leggen.

In dit geval 50 milliseconden. Neem foto's op over een voldoende tijd, bijvoorbeeld drie minuten. Als u ruis uit elke afbeelding wilt verwijderen, trekt u de achtergrond af, het gemiddelde van de som van alle opgenomen afbeeldingen.

Bepaal de modulus van het numerieke verloop en normaliseer deze met de maximale waarde. Zoek en neem bacteriële coördinaten en het tijdstip van beeldverwerving op in een bestand met drie kolommen. Voer deeltjestrackinganalyse uit om de opgenomen gegevens te verwerken en de trajecten te berekenen.

Om depositieprofielen te verkrijgen, registreert u een samengesteld beeld van het gehele poreuze kanaal vóór, dat is de achtergrond, en na injectie van de bacteriële suspensie door het microfluïde apparaat. Verwijder de achtergrond van de beelden die zijn opgenomen na bacteriële injectie. Besle lang het depositieprofiel D als de som van het bacteriële fluorescentiesignaal langs transversale delen van lengte x van het poreuze kanaal.

Visualiseer het depositieprofiel als het lokale fluorescentiesignaal ten opzichte van de poreuze kanaallengte. Om de automatische dispenser in te stellen, plaatst u de robotdispenser dicht bij het vloeistofapparaat. Sluit de robotdispenser aan op de computer waarop BCNC draait en identificeer de juiste com-poort.

Klik in BCNC op de thuisknop om de robotdispenser terug te brengen naar de thuispositie. Sluit de peristaltische pomp met de inlaat met behulp van 50 centimeter lang, een millimeter binnendiameter buizen, en de uitstroom met de automatische dispenser met behulp van dezelfde slang. Pomp teeltmedium door het vloeibare apparaat.

Let op de komst van medium bij de uitlaatbuizen die aan de robotautomaat zijn bevestigd en plaats een 96-putplaat die de uitstroom zal verzamelen. Activeer tegelijkertijd de robotdispenser en injecteer de bacteriële suspensie via het PMMA-vloeistofapparaat met een stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut. Injecteer bacteriële suspensie gelijk aan verschillende porie volumes.

Bijvoorbeeld, 30 keer het volume van het vloeibare apparaat. Na injectie overschakelen naar steriel teeltmedium tot het einde van het experiment. Zodra een 96-put plaat is voltooid, dek de plaat en bewaar op vier graden Celsius tot de stroom cytometrie analyse.

Analyseer monsters met stroomcytometrie en visualiseer baanbrekende rondingen door de effluent bacteriële concentratie C te normaliseren met de influent bacteriële concentratie C0 en C te plotten boven C0 versus tijd. In deze studie, met behulp van zowel motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440, sequentiële experimenten werden uitgevoerd in PDMS microfluïde apparaten met een willekeurige array van pijlers. Doorbraakcurven genormaliseerd tot de concentratie van geïnjecteerde cellen, evenals bacteriële trajecten op de porieschaal worden hier weergegeven.

Experimenten met grootschalige vloeistofapparatuur gefreesd van PMMA werden ook uitgevoerd. Motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 werden geïnjecteerd in een regelmatig gespreide poreuze matrix. Opvallend, in een poreuze omgeving verstoken van biofilm, motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 toonde een duidelijk ander transport gedrag op basis van baanbrekende bochten.

In een poreuze matrix gekoloniseerd voor 48 uur met een complexe stroom biofilm gemeenschap, deze verschillen in doorbraak curven tussen motile en niet-motile Pseudomonas putida KT2440 verdwenen. We gebruiken dit systeem om bacterieel transport in de stromen te bestuderen, maar deze hulpmiddelen kunnen gemakkelijk worden aangepast om bacteriële transportverschijnselen in andere ontworpen en milieusystemen te bestuderen. Bacterietransport door gehydrateerde poreuze media kapselt processen over meerdere ruimtelijke schalen.

De hier gepresenteerde methodologie maakt het mogelijk om de lokale verplaatsing van bacteriën op de porieschaal te koppelen aan het microscopisch transport op het gehele poreuze medium.