Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

Kynureninen worden geassocieerd met regulatie van de immuunrespons bij verschillende ziekten, waaronder kanker. Betrouwbare en gevalideerde methoden voor het identificeren van meerdere kynureninen helpen bij de ontwikkeling van effectievere therapieën. Ons protocol gebruikt vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie om de verschillende tryptofaanmetabolieten te identificeren die worden gegenereerd door de kynurenineroute in medium dat is verzameld uit kankercelculturen.

Onervaren gebruikers kunnen enkele moeilijkheden ondervinden tijdens de staalvoorbereiding of gegevensverwerving en -interpretatie. Door ons protocol en aanbevelingen te volgen, kan men fouten vermijden en betrouwbare gegevens verkrijgen. Om voorraadoplossingen van de reagentia voor te bereiden, weegt u 0,3 milligram van elk reagens af in een glas tot de hoogste nauwkeurigheid en lost elk reagens op in 300 microliter van het geschikte oplosmiddel om voorraadoplossingen van één gram per liter van elk reagens te verkrijgen.

Om koolstofbehandeld kweekmedium voor te bereiden, weegt u 280 milligram geactiveerde koolstof af in een conische buis en voegt u vijf milliliter van het vloeibare medium toe dat is voorbereid voor het kweken van de cellen van belang. Schud de buis met het medium en de koolstof op een schommelbank gedurende twee uur bij kamertemperatuur en 50 oscillaties per minuut. Aan het einde van de incubatie, sedimenteert u de koolstof door centrifugatie en verzamelt u voorzichtig het supernatant zonder de koolstof te verstoren, en filtert u vervolgens het medium met een 0,45 micrometer spuitfilter.

Om de kalibratieoplossing voor te bereiden, behandeld u het koolstofbehandelde kweekmedium met 0,75 microliter van een 0,1 gram per liter 3NT-oplossing en voegt u 3-H kynurenine, 3-HAA kynurenine en xanthurenezuur toe aan minstens zes verschillende concentraties om alle kalibratiebereiken te dekken tot een eindvolume van 150 microliter per monster. Na het mengen, voegt u 150 microliter koude methanol van min 20 graden Celsius toe dat is aangevuld met 1% formiatezuur aan elke buis voor monsterdeproteinisatie en sluit u de buizen stevig af en mengt u de buizen opnieuw. Na een incubatie van 40 minuten bij min 20 graden Celsius, centrifugeert u de monsters en gebruikt u een automatische pipet om 270 microliter van elk supernatant over te brengen in individuele glazen buisjes met platte bodem.

Plaats de buisjes in een verdamper en gebruik het geschikte programma voor water methanol fracties om de vluchtige componenten gedurende ongeveer 30 minuten voorzichtig te verdampen. Wanneer de buisjes droog zijn, stelt u elk monster samen in 60 microliter van 0,1% formiatezuur in water en mengt u de monsters voordat u elke oplossing overbrengt in individuele 1,5 milliliter buisjes voor centrifugatie. Zonder de sedimenten te verstoren, brengt u de supernatanten over in chromatografische buisjes met conische glazen inzetstukken en plaatst u de buisjes in een LC-MS automatische sampler.

Voordat u de monsters uitvoert, zuivert u het LC-systeem met de mobiele fase om luchtbellen te verwijderen en om alle oplosmiddelkanalen te primen. Spoel vervolgens de bescherm- en analytische kolom gedurende ongeveer 30 minuten met 100% acetonitril voordat u het systeem spoelt met 100% oplosmiddel A totdat een stabiele druk in de kolom wordt waargenomen, stel vervolgens de geschikte LC-parameters in de gegevensverwervingssoftware in en maakt u een werklijst voor het uitvoeren van de monsters op het LC-systeem. Om de kalibratiecurve te construeren, voegt u in de gegevensverwervingssoftware de kalibratiestandaarden toe aan de werklijst en voert u de standaarden in drievoudig uit, meet vervolgens en meet de piekgebied overeenkomend met 3-hydroxykynurenine, kynurenine, 3-hydroxyanthranilinezuur, 3-nitrotyrosine en xanthurenezuur bij de retentietijden van respectievelijk ongeveer 4,4, 10, 16, 21 en 30 minuten.

Om supernatant monsters te verzamelen van een in vitro celcultuur, draagt u na 48 uur standaardcelcultuur van de cellen van belang 500 microliter supernatant van elk putje over in individuele 1,5 milliliter buisjes en verwijdert u het cellulaire puin door centrifugatie, vervolgens brengt u de medium supernatanten over in nieuwe buisjes voor opslag bij min 80 graden Celsius tot de analyse en bewaart u de celpellets bij min 20 graden Celsius tot de eiwitschattingsanalyse. Om monsters voor LC-MS-analyse voor te bereiden, brengt u 149,25 microliter van elk ontdooid kweekmedium monster over in een nieuw 1,5 microliter buisje en voegt u 0,75 microliter van een 0,1 gram per liter 3NT-oplossing toe aan elke buis. Na de monsters zoals aangetoond te hebben voorbereid, voegt u 150 microliter van min 20 graden Celsius methanol toe dat is aangevuld met 1% formiatezuur aan elke buis en bereidt u het monster voor LC-MS-analyse voor zoals aangetoond.

Wanneer de werklijst volledig is, meet u het piekgebied van elke analyt en gebruikt u een individuele lineaire kalibratie-vergelijking gewijd voor elke analyt om concentraties van de analyten te berekenen die aanwezig zijn binnen elk experimenteel monster. Om de cellulaire eiwit inhoud overeenkomend met het monster van kweekmedium te beoordelen, suspendeert u elk cellulair pellet opnieuw in 100 microliter PBS en bevriest u de monsters bij min 20 graden Celsius gedurende een uur voordat u ze op ijs ontdooit. Na het drie keer bevriezen en ontdooien van de monsters, verzamelt u de cellulaire lysaten door centrifugatie en brengt u de supernatanten over in nieuwe buisjes zonder de pellets te verstoren.

Verdun het monster 10 keer met vers PBS en voeg de juiste volumes van bovien serumalbumine standaardoplossing in duplicaat toe aan de geschikte putjes van een 96-putjesplaat. Laad 10 tot 15 microliter van elk cel lysate monster supernatant naar de geschikte putjes van de 96-putjesplaat en vult u zowel de standaard als monster putjes tot een eindvolume van 50 microliter PBS per putje. Voeg vervolgens 200 microliter van een Bradford reagens toe dat vijf keer is verdund met ultra zuiver water aan el