Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Sample Chamber-Based Light Sheet Florescence Microscopes zijn ontworpen voor hoge inhoud in plaats van hoge doorvoer. Live beeldvormingstests moeten daarom sequentieel worden uitgevoerd en dus minder worden beïnvloed door omgevingsvariatie. Onze webhouder maakt stapelen en gelijktijdige beeldvorming van meerdere embryo's mogelijk, waardoor omgevingsvariatie wordt geëlimineerd en de doorvoer wordt verhoogd.

Het monteren van embryo's in de webhouder vereist een zekere finesse. Een verklarende video is ideaal voor het illustreren van de volgorde van de vele korte gedragsgebaren. Voor kalibratie van de Sample Chamber-Based van de Light Sheet Fluorescerende Microscoop.

Eerst reliqueficeer een agarose-aliquot in een droge blokhoudermixer op 80 graden Celsius. Laat de gesmolten agarose afkoelen tot 35 graden Celsius en breng 50 microliter van de agarose over in een reactiebuis van 1,5 milliliter. Meng 0,5 microliter van de oplossing met fluorescente microsferen met de agarose bij 1.400 omwentelingen per minuut gedurende één minuut en vul het sleuvengat van de webhouder met 10 microliter van het mengsel van de agarose-oplossing met fluorescente microsferen.

Zuig zoveel mogelijk agarose af tot er slechts een dunne agarosefilm overblijft en laat de agarose 30 tot 60 seconden stollen. Vul de monsterkamer met geautoclaveerd kraanwater en plaats de webhouder langzaam in de monsterkamer. Verplaats het sleuvengat voor de detectielenzen en draai de houder naar een 45-graads positie ten opzichte van de verlichtings- en detectieassen.

De webhouder mag niet zichtbaar zijn in het transmissielichtkanaal. Schakel over naar het juiste fluorescentiekanaal en pas de laservermogen en belichtingstijd aan, zodat de fluorescente microsferen een goed signaal geven. Specificeer een weergavevolume dat de nu dwars georiënteerde agarosefilm volledig bedekt en bereken de maximaal mogelijke axiale resolutie voor de respectieve verlichtings- en detectielenzencombinatie om de Z-afstand te definiëren.

Neem vervolgens een driedimensionale test-Z-stack van de fluorescente microsferen op en vergelijk de X-, Y- en Z-maximale projecties met het kalibratiekaart. Als de microsferen er wazig, troebel en/of vervormd uitzien. Pas de posities van de verlichtings- en/of detectielenzen aan.

Voor embryodechorionatie voegt u acht milliliter geautoclaveerd kraanwater toe aan de A1, A2, A3 en B3 cellen van een zes-putjesplaat per lijn. Voeg vervolgens zeven milliliter geautoclaveerd kraanwater en één milliliter natriumhypochlorietoplossing toe aan de B1 en B2 cellen. Plaats de eerste plaat onder een stereomicroscoop en plaats de eerste embryo bevattende celzeef in de A1 cel.

Was de embryo's onder lichte agitatie gedurende 30 tot 60 seconden voordat u de zeef naar de B1 cel verplaatst. Schud de plaat krachtig gedurende 30 seconden voordat u de zeef naar de A2 cel verplaatst. Was de embryo's gedurende één minuut onder lichte agitatie en verplaats de zeef naar de B2 cel voor krachtig schudden tot de meeste embryo's volledig zijn gedechorioneerd.

Breng vervolgens de zeef over naar de A3 cel voor één minuut zacht wassen, voordat u de zeef met gedechorioneerde embryo's in de B3 cel bewaart tot de embryo's van andere lijnen zijn behandeld zoals gedemonstreerd. Om de embryo's op de webhouder te monteren, reliqueficeer nog een aliquot agarose zoals gedemonstreerd. Wanneer de agarose is afgekoeld, plaats de webhouder onder de stereomicroscoop en breng 10 microliter van de agarose aan op het sleuvengat.

Gebruik de pipettetip om de agarose over het sleuvengat te verspreiden, voordat u zoveel mogelijk agarose afzuigt tot er slechts een dunne agarosefilm overblijft. Wanneer de agarose is gestold, gebruikt u een penseel om de embryo's voorzichtig op te pakken en over te brengen naar de agarosefilm. Schik ze langs de lange as van het sleuvengat met hun anterior-posterior-assen uitgelijnd met de lange as van het sleuvengat.

Om de embryo's te stabiliseren, pipetteer voorzichtig een tot twee microliter agarose in de opening tussen de embryo's en de agarosefilm. Wanneer de agarose is gestold, plaatst u de webhouder met de gemonteerde embryo's langzaam in de monsterkamer gevuld met beeldbuffer. Om de embryo's te beeldvormen, bevestigt u dat de webhouder in een 45-graads positie ten opzichte van de verlichtings- en detectieassen en in het transmissielichtkanaal staat, verplaatst u het embryo naar het midden van het gezichtsveld.

De webhouder mag niet zichtbaar zijn. Verplaats vervolgens het embryo met de microtranslatietrap in Z tot het middelste vlak van het embryo overlapt met het brandpuntsvlak en de omtrek scherp lijkt. Zonder over te schakelen naar het fluorescentiekanaal, verplaatst u het embryo 250 micrometer in beide richtingen om het weergavevolume te specificeren.

Als beeldvorming in meerdere richtingen vereist is, draait u het embryo op de juiste manier, brengt u het embryo scherp en specificeert u het weergavevolume zoals zojuist is gedemonstreerd. Herhaal vervolgens deze procedure voor alle andere gemonteerde embryo's. Wanneer het weergavevolume voor alle embryo's is gespecificeerd, definieert u het fluorescentiekanaal en de time-lapseparameters en start u het beeldvormingsproces.

Voor tests die enkele dagen duren, overweeg om de opening van de monsterkamer ten minste gedeeltelijk te bedekken om verdamping te verminderen. Wanneer de beeldvormingstest is afgelopen, verwijdert u voorzichtig de webhouder uit de monsterkamer en gebruikt u een klein penseel om de embryo's los te maken van de agarosefilm en om de embryo's op een geschikt gelabelde microscoopglaasjes te plaatsen. Plaats het glaasje in een opvangschaal voor incubatie onder de juiste standaardkweekomstandigheden.

Naarmate het uitkompunt nadert, controleert u de opvangschalen regelmatig en brengt u eventuele uitgekomen larven over naar afzonderlijke cellen van een 24-celsplaat. Vul de cellen halverwege met het juiste groeimedium en incubeer de larven vervolgens onder de juiste standaardkweekomstandigheden. Wanneer de waargenomen individuen volwassen worden, zorg voor geschikte paringspartners en controleer na enkele dagen op nakomelingen.