Mechanische scheiding en eiwitsnoerlubilisatie van de buitenste en binnenste Perivitelline-sublagen van kippeneieren

Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om de perivitellinemembraansublagen uit aviaire eieren te bemonsteren voor verder onderzoek naar hun fysiologische rol bij de voortplanting van vogels. De bemonstering van het perivitellinemembraan is bij elke stap geoptimaliseerd om eventuele structurele en moleculaire schade te beperken. Het protocol is verder ontwikkeld voor diepgaande proteomics.

Begin met het bemonsteren van de perivitellinelaag of PL uit een vers gelegd onbevrucht ei. Breek het ei en gebruik een eierscheider om de dooier van het wit te scheiden. Verwijder de chalazae met een kleine schaar en rol de dooier over een filterpapier om aanhangend albumine te verwijderen dat verschijnt als een transparante maar zichtbare structuur.

Dooier onderdompelen in een kristallisator met 10 millimolar Tris HCL bij pH acht die eerder is afgekoeld tot vier graden Celsius en verwijder het PL-gebied over de kiemschijf binnen een zone van één centimeter met een stompe schaar. Scheur de PL met een kleine schaar in de buffer, houd vervolgens de twee randen van de gescheurde PL met een tang vast en pel deze van de dooier. Spoel de PL meerdere keren in baden van 10 millimolar Tris HCL totdat er geen spoor van dooier zichtbaar is.

Zorg ervoor dat de PL schoon, wit en zwevend in de buffer is. Verwerk de PL voor onderlaagscheiding of ga direct over tot biochemische analyses. Om de OPL en IPL te scheiden, verspreidt u het hele monster met de OPL naar boven gericht in een plastic Petrischaal gevuld met 10 millimolar Tris HCL en 50 millimolar natriumchloride en onderhoudt u het plat met zo min mogelijk rimpels.

Bepaal de locatie van de resterende chalazae die alleen aan de OPL zijn gekoppeld. Snijd vervolgens de hele PL in stukjes van ongeveer twee bij drie centimeter met een kleine schaar. Scheid de twee lagen mechanisch met ultranauwkeurige tip forceps onder een ontleedmicroscoop.

Bewaar de resulterende IPL- en OPL-monsters afzonderlijk in microbuizen bij negatief 80 graden Celsius tot verder gebruik. Om primaire eiwitoplosbaarheid uit te voeren, vriest u de IPL- en OPL-monsters afzonderlijk in om het resterende water te verwijderen, knipt u vervolgens ongeveer één milligram uit elk monster en plaatst u het in een schone microbuis met een lekvrije schroefdop. Bewaar de resterende monsters in goed gesloten buizen voor langdurige opslag bij negatieve 20 of negatieve 80 graden Celsius.

Meng één milligram van elke lyophilized sublaag met 400 microliters van 50 millimolar Tris bij pH zeven en 500 millimolar natriumchloride. Gebruik een mengmolen tweemaal gedurende vijf minuten op 30 Hertz om de structuren te desintegreren tot microdeeltjes en eiwitsamenstelling te vergemakkelijken. Verzamel 400 microliters van de monsters in twee schone microbuizen.

Om de monsters voor te bereiden op elektroforese, voegt u 5X SDS-PAGE monsterbuffer toe aan elk monster van 400 microliter en verwarmt u het gedurende vijf minuten tot 100 graden Celsius. Laad maximaal 20 microgram eiwitten in elke baan van een 4-20% gradiënt SDS polyacrylamide gel en voer elektroforese uit bij 120 volt. Verwijder na elektroforese de gel van de glasplaten en beits deze gedurende 30 minuten met Coomassie Brilliant Blue-oplossing en ontsmet vervolgens met een oplossing bestaande uit 50%water, 40%ethanol en 10%azijnzuur totdat de gelachtergrond lichtblauw lijkt.

Doe de gel in een Petrischaal met gedeïenstitueerd water voor het ontsmetten en opnieuw hydrateren. Eiwitten moeten verschijnen als blauwe banden met een transparante achtergrond. De PL werd onderworpen aan verschillende buffers om omstandigheden te identificeren die minimaal eiwitverlies en optimale scheiding van de onderlaag mogelijk maken.

Eiwitten die vrijkomen bij verschillende Tris-concentraties, pH- en natriumchlorideconcentraties worden hier weergegeven. De resulterende twee onderlagen werden waargenomen onder een ontledende microscoop. IPL is doorschijnend, terwijl OPL dicht, bewolkt en witachtig is.

Na de scheiding werden OPL en IPL onafhankelijk gelyophiliseerd en werd hun eiwitgehalte volledig opgelost met behulp van een combinatie van mechanisch slijpen, een anionisch wasmiddel, een reduceermiddel en koken. De monsters vertoonden verschillende elektroforetische profielen op een polyacrylamidegel. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat scheiding van de onderlagen een kritieke stap van de procedure is en moet worden uitgevoerd met behulp van een verrekijkermicroscoop in een buffer met een minimale concentratie zout.

Om hun respectieve fysiologische functie verder te verduidelijken, kunnen de monsters van de perivitellinemembraansublaag worden geanalyseerd op histologische karakterisering met behulp van elektronische microscopie en voor functionele studies met behulp van beeldvormingstests en celmigratie.