Name: Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer longmetastase kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met computerondersteunde beeldanalyse via Fiji-ImageJ. Deze methode vermindert menselijke tel fouten en versnelt onderzoek naar borstkankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), het Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) en National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het uitvoeren van dit protocol vereist toestemming van de juiste instellingen en naleving van alle juiste richtlijnen.
1. Celcultuur
<ol><li>Maak complete kweekmedia (RPMI + 10% Foetale Runder Serum +1% Pen Strep). Herleef 4T1 cellen volgens ATCC Protocol10 en broed bij 37 °C en 5% CO2 in een T-25 kolf tot confluent. Verander media de dag na het herleven om dode cellen te verwijderen, en opnieuw als de media wordt besteed voordat cellen zijn confluent genoeg om passage.</li>
	<li>Zodra de T-25 kolf is confluent, passage cellen naar een T-75 kolf door het weggooien van media, waskolf met 5 mL van 1x Dulbecco's Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (DPBS), en het toevoegen van 500 μL van Trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.<ol>
<li>Eenmaal losgemaakt, voeg 5 mL van opgewarmde complete cultuur media aan cellen. Aspirate en breng de 5 mL over naar een T-75 kolf met 15 mL opgewarmde complete cultuurmedia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passagecellen in T-75 kolven minstens vier keer. Doe dit zodra de kolf is confluent door het wassen met 8 mL van 1x DPBS, het toevoegen van 1 mL van Trypsin-EDTA voor het losmaken van cellen, het toevoegen van 10 mL van opgewarmde media aan cellen, en verdunnen 1:6-1:8 in een nieuwe T-75 kolf met 20 mL van opgewarmde volledige cultuur media.</li>
	<li>Passagecellen tot het juiste aantal T-150 kolven met 40 mL opgewarmde volledige kweekmedia voor het aantal te injecteren muizen. De meeste studies vereisen meerdere T-150 kolven om voldoende cellen te garanderen voor injectie.</li>
	<li>Wanneer muizen klaar zijn om te worden geïnjecteerd (8 weken oud of een gewicht van meer dan 20 g, afhankelijk van de IACUC of institutionele protocollen), oogst cellen door het weggooien van media, het wassen van elke kolf met 10 mL van 1x DPBS en het toevoegen van 2 mL trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.</li>
	<li>Was kolf met 10 mL volledige media en breng alle inhoud (10 mL media + 2 mL trypsin-EDTA celmengsel) over naar de volgende kolf. Blijf cellen uit elke kolf wassen en verzamelen met dezelfde 10 mL media om te voorkomen dat u een te grote hoeveelheid media gebruikt.<ol>
<li>Zodra alle kolven zijn verzameld, breng de inhoud in een 50 mL centrifuge buis. Verzamel een monster van 10 μL voor het tellen in een microcentrifugebuis en centrifugeer de 50 mL conische buis op 125 x g gedurende 5 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terwijl cellen worden gecentrifugeerd, voeg 10 μL Trypan blauw toe aan 10 μL celmonster. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Zodra het totale aantal cellen is bepaald, berekent u de concentratie cellen die nodig zijn om muizen te injecteren voor 1,2 x 106 cellen per muis (per 100 μL).</li>
	<li>Na centrifugatie, decanteren media en resuspend cell pellet in de juiste hoeveelheid steriele 1x DPBS voor 1,2 x 106 cellen per 100 μL. Split cel / DPBS mengsel in microcentrifuge buizen voor gemakkelijke toegang met de spuit bij het aspirating cellen voor injectie. Houd cellen op ijs en injecteer kort daarna als cellen zullen beginnen te sterven na langere tijd op ijs te zijn.</li>
</ol>2. Injecties
<ol><li>Bereid cellen voor op injectie door de microcentrifugebuis te tikken of voorzichtig te mengen om de cellen opnieuw op te zetten en vervolgens 600 μL in een spuit van 1 mL aan te trekken. Draai de spuit naar boven en trek de zuiger naar beneden om cellen weg te brengen van de spuit opening. Tik op de spuit om het te ontdoen van luchtbellen.</li>
	<li>Bevestig de naaldschuin en geef cellen terug in de microcentrifugebuis tot er slechts 500 μL in de spuit blijft. Zet spuit plat op ijs. LET OP: 4T1 cellen vallen snel uit de suspensie. Daarom is het belangrijk om cellen terug te mengen in suspensie door vaak te tikken.</li>
	<li>Verdoes 8 weken oud/>20 g vrouwelijke BALB/c muis met isoflurane of ander goedgekeurd verdovingsmiddel. Controleer de ademhaling van de muis om de diepte van anesthesie te beoordelen.</li>
	<li>Zodra de muis goed is verdoofd, zoals aangegeven door gebrek aan hoornvliesreflex, plaats de muis op zijn rug. Houd met de duim, aanwijzer en middelvinger de muis voorzichtig ingedrukt. Gebruik de aanwijzer en middelvingers om het bovenlichaam en de duim van de muis in te houden voor het linkerachterbeen. Wees zachtaardig, maar stevig.</li>
	<li>Met de schuine kant van de naald omhoog, injecteer 100 μL van cellen onderhuids in de linker buikslachtige vetmat van de muis. Monitor voor een goede bleb en eventuele lekkage, en zorg ervoor dat de muis wakker wordt en beweegt gemakkelijk na de injectie.<ol>
<li>Wissel naalden tussen elke muis. LET OP: Laat naald niet in de buikholte komen. Dit zou ertoe leiden dat de kanker zich snel verspreidt en niet representatief is voor het model. Om een onderhuidse injectie te garanderen, trek voorzichtig naar boven op de naald wanneer ingebracht in de linker buik borst vet pad. Als de naald gemakkelijk naar boven wordt getild, wordt deze correct onderhuids geplaatst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.
<ol><li>Monitor muizen ten minste 3 keer per week voor gewicht, lichaamsconditie score, tumor grootte, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, en beweging. Zodra de tumor bereikt 0,7-0,8 cm in diameter, beginnen dagelijks te controleren.<ol>
<li>Overweeg euthanasie wanneer de tumor grootte bereikt 1,5 cm, of gewichtsverlies bereikt 20%, of ernstige klinische daling van de lichaamsconditie score, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, of beweging worden waargenomen op basis van institutionele richtlijnen. OPMERKING: Body condition score is cruciaal om te controleren als lichaamsgewicht kan toenemen als de tumor toeneemt in omvang, ontkennen lichaam conditie verlies als gevolg van ziekte last. Exacte monitoringprotocollen zijn afhankelijk van de goedgekeurde IACUC- of institutionele protocollen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Obductie
<ol><li>Euthanaseren muis met behulp van CO2 volgens institutionele richtlijnen.</li>
	<li>Spray muis met 70% ethanol te desinfecteren. Maak een incisie van de ventrale middellijn van de muis om de lichaamsholte bloot te stellen.</li>
	<li>Verwijder de nier. Blijf de middellijn snijden totdat het middenrif zichtbaar is. Gebruik een schaar om het middenrif te doorboren om de longen leeg te laten lopen. Knip het middenrif om een betere toegang tot de holte te krijgen.</li>
	<li>Gebruik een stompe schaar om het midden van de ribbenkast te snijden. Pin ribcage terug om de long en het hart bloot te leggen.</li>
	<li>Doorsloop het hart met 2 mL van niet-steriele 1x DPBS door het inbrengen van een naald in de top van het hart totdat het zwembaden in de buikholte waar de nier werd verwijderd.</li>
	<li>Om het hart en de longen te verwijderen, gebruik botte schaar om de slokdarm en luchtpijp direct boven het hart te snijden. Met behulp van tangen, beginnen om het hart weg te trekken van het lichaam en weggesneden op een bindweefsel houden het aan. De longen komen naar buiten met het hart.</li>
	<li>Identificeer de multi-lobed (rechts) en single-lobed (links) longen. Houd het hart bevestigd voor referentie, maar zodra de longen zijn geïdentificeerd, snijd het hart weg.</li>
	<li>Label een 12 put plaat met 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) in elke put. Elke muis heeft 2 putten nodig. Plaats de multi-gelobde (rechter) long in de 12 put plaat voor metastase evaluatie en houd op ijs. Houd de naburige goed leeg voor nu. OPMERKING: Het is belangrijk om dezelfde long (multi-lobed) van elke muis te gebruiken om ervoor te zorgen dat elk monster dicht in grootte is. De single-lobed long kan dan worden gebruikt voor andere analyse, zoals histopathologie. LET OP: Monsters zijn stabiel op ijs of op 4 °C voor een paar uur.</li>
</ol>5. Verwerkingsweefsels
LET OP: Alle stappen in deze sectie moeten worden gedaan met behulp van steriele techniek.
<ol><li>Label 1 15 mL conische buis per muis en voeg 2,5 mL van type IV collagenase mengsel en 30 eenheden elastase aan elke buis. Om het collagenasemengsel van type IV te maken, los 2 mg collagenase van type IV per mL 1x HBSS en steriel filter op. Dit kan tot 12 maanden bij -20 °C worden opgeslagen en ontdooid wanneer dat nodig is.</li>
	<li>Breng de long naar de tweede, schoon 1x HBSS goed voor dat monster. Wervel met behulp van tangen om het resterende bloed te verwijderen. Breng schone long over naar lege 3,5 cm weefselkweekplaat. Gehaktlong met schaar. Spoel plaat met 2,5 mL van 1x HBSS, breng 1x HBSS en longstukken in een 15 mL conische buis die al collagenase/elastase cocktail bevat (5 mL totaal).</li>
	<li>Incubeer gedurende 75 minuten bij 4 °C. Blijf gedurende deze tijd monsters mengen, dus plaats buizen op een tuimelschakelaar of roterend wiel. Tijdens deze incubatiestap labelt u 50 mL centrifugebuizen en 10 cm weefselkweekplaten voor elke muis. Bij het doen van een verdunning, etiket genoeg 10 cm weefsel kweekplaten voor de verdunningen. LET OP: Label het deksel van de weefselkweekplaten. Als het labelen van de plaat zelf, het schrijven zal interfereren met Fiji-ImageJ analyse.</li>
	<li>Breng het volume van elke buis tot 10 mL in totaal met 1x HBSS. Giet de inhoud over een 70 μm celzeef in een conische buis van 50 mL voor elk monster. Gebruik de zuiger van een spuit van 1 mL om het monster voorzichtig door de zeef te malen om meer cellen door te laten filteren.</li>
	<li>Centrifuge gedurende 5 minuten bij 350 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en waspellet met 10 mL 1x HBSS. Herhaal deze stap twee keer.</li>
	<li>Resuspend pellet in 10 mL of 60 μM 6TG complete cultuurmedia, rpmi of IMDM. Plaatmonsters in 10 cm celkweekplaten, indien gewenst met behulp van een verdunningsschema. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 5 dagen. OPMERKING: 1:2, 1:10 en 1:100 zijn veelvoorkomende verdunningen die empirisch moeten worden bepaald op basis van studieparameters. LET OP: 6TG is giftig. Wees voorzichtig bij het hanteren en volg alle richtlijnen voor milieugezondheid en veiligheid voor verwijdering.</li>
</ol>6. Kleurplaten
<ol><li>Giet cultuurmedia van platen in geschikte afvalcontainer. Fix cellen door het toevoegen van 5 mL van onverdunde methanol per plaat en incubeer gedurende 5 minuten op RT, zorg ervoor dat methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt. LET OP: Methanol is gevaarlijk bij inname, ingeademd of op de huid. Gebruik een rookkap voor deze stap.</li>
	<li>Giet methanol van platen in de juiste afvalcontainer. Spoel borden met 5 mL gedestilleerd water per plaat en giet water in de juiste afvalcontainer. Voeg 5 mL van 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed gedurende 5 minuten bij RT, zorg ervoor dat u de methyleenblauwe oplossing wervelt, zodat deze de hele plaat bedekt.</li>
	<li>Giet methyleenblauw in de juiste afvalcontainer. Spoel de platen opnieuw af met 5 mL gedestilleerd water per plaat. Draai platen ondersteboven en dep tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats de plaat op het deksel en laat de lucht 's nachts drogen bij RT. LET OP: Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn. Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij RT.</li>
</ol>7. Beeldanalyse
<ol><li>Verwijder gelabelde deksels van platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Line-up alle gekleurde longplaten op een schone, lichte oppervlak om een foto van alle platen in een beeld te nemen.</li>
	<li>Maak een foto van de collectie platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren als de platen zijn zeer reflecterend. Reflecties in de platen zullen de beeldanalyse beïnvloeden en moeten daarom worden vermeden. LET OP: Fiji-ImageJ heeft een bovengrens van 2 gigapixels. De meeste moderne smartphones zullen voldoende camera's hebben. Gebruik geen camera van minder dan 8 megapixels. De camera die in dit experiment werd gebruikt was een 12,2 megapixel op een Google Pixel 2.</li>
	<li>Snijd de afbeelding bij om de platen op te nemen, maar sluit de deksels of iets anders op de achtergrond van de afbeelding uit. Upload de bijgesneden afbeelding naar Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Wijzig de afbeelding in zwart-wit met behulp van de volgende opdrachten: Afbeelding, Aanpassen, Kleurdrempel, Drempelmethode: Standaard, Drempelkleur: B&W, Drempelruimte: Lab. Schakel het achtergrondvak Donker uit. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.</li>
	<li>Selecteer met het gereedschap Cirkel op de werkbalk Fiji-ImageJ het te analyseren gebied. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt. De grootte verschijnt in de werkbalk als deze wordt getekend, dus het is mogelijk om een perfecte cirkel te maken door de hoogte en de breedte te bewaken terwijl de cirkel wordt getekend.</li>
	<li>Analyseer de geselecteerde cirkel om te bepalen welk percentage van het gebied wit is, wat het gebied van de plaat vertegenwoordigt dat blauwe uitgezaaide kolonies heeft. Gebruik de volgende opdrachten: Deeltjes analyseren, verkleinen (pixel2):0-Oneindigheid, Circulariteit: 0,00-1,00, Weergeven: Niets en schakel het selectievakje Samenvatten in. Raak OK.</li>
	<li>Nota van het % gebiedsresultaat. Dit is het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is en dus de uitgezaaide last vertegenwoordigt. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de resultaten op te slaan in Fiji-ImageJ of de volledige resultatenpagina te kopiëren/plakken in een apart document. Als de resultaten van het gebied van % onverwacht of verdacht zijn, is het mogelijk om te zien of een van de andere metingen ook verdacht waren of dat % gebied onjuist is geregistreerd.</li>
	<li>Verplaats de cirkel, zonder de grootte te veranderen door het in het midden te grijpen, naar de volgende plaat op de foto. Herhaal stap 7.6 en 7.7 voor alle platen op de foto.</li>
	<li>Herhaal stap 7.1 – 7.8 op ten minste twee beelden. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het % gebied resultaten tussen de verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te verminderen.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+established+spontaneous+mammary+carcinoma+metastases+following+immunotherapy+with+major+histocompatibility+complex+class+II+and+B7.1+cell-based+tumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines.</a> Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li>
<li>Sikpa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+quantification+of+breast+cancer+brain+metastases+in+an+animal+model+using+democratized+machine+learning+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17333(2019).</li>
<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
<li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals aangetoond, kan het handmatig tellen van de gemetastaseerde kolonies op elke longplaat een onnauwkeurige en onnauwkeurige methode zijn om longmetastase te kwantificeren, wat de noodzaak van een beter kwantificeringsmiddel aantoont (figuur 2). Histopathologische analyse verschilde enigszins van zowel handmatig tellen als Fiji-ImageJ-analyse(figuur 2B en 4D),waarschijnlijk omdat de H&E-dia's geen representatief monster van het hele orgaan zi...

Een op de acht vrouwen zal worden gediagnosticeerd met borstkanker in haar leven, en toch ondanks meerdere behandeling opties borstkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij Amerikaanse vrouwen1. Deze vrouwen sterven niet aan de primaire tumor in hun borst. In plaats daarvan is de uitgezaaide last verantwoordelijk voor de mortaliteit van deze ziekte omdat deze zich vaak verspreidt naar de longen, het bot, de hersenen, de lever en de lymfeklieren2. Daarom moeten borstkankermodellen metastase evalueren om bij te dragen aan het terugdringen van de sterfte van deze ziekte. De 4T1 murine borstkanker model is een prachtig protocol om dit te bereiken. De hier beschreven methode biedt een verbetering van het 4T1-model door Fiji-ImageJ te gebruiken om longmetastase te kwantificeren, wat consistente en snelle resultaten oplevert.
De 4T1 model is goed ingeburgerd, met de meeste laboratoria met behulp van protocollen zoals die beschreven door Pulaski en Ostrand-Rosenberg in 20013. De 4T1-cellijn is 6-Thioguanine (6TG) resistent en representatief voor stadium IV, drievoudig negatief borstkanker3,4,5. Het is klinisch relevant omdat het een orthotopisch model is en spontaan uitzaait naar dezelfde organen als bij borstkanker bij de mens3,4. De 4T1-cellen metastaseren spontaan in een voorspelbaar tempo op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde cellen3,4. Belangrijk is dat genetische verschillen tussen muizen die hier worden gebruikt, de verwachte inter-individuele variabiliteit in gemetastasaire lasten veroorzaakten. Om metastase te evalueren, worden weefsels geoogst om kankercellen in verre gebieden te verzamelen en te kwantificeren met behulp van 6TG-selectie en methyleenblauwe vlekken. Het resultaat is een verzameling weefselkweekplaten met blauwe stippen die uitgezaaide kolonies vertegenwoordigen. Het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg-protocol kwantificeert echter gemetastaseerde kolonies door ze handmatig te tellen, en daarom is dit het standaardmiddel geweest om metastase in dit model te evalueren. Hoewel dit gemakkelijk is voor weefsels met een lage uitgezaaide belasting, weefsels zoals de longen zijn vaak beladen met uitzaaiingen. Aangezien longplaten zeer vloeiend kunnen zijn, is het nauwkeurig en nauwkeurig kwantificeren van uitgezaaide gemetastaseerde kolonies door handmatig tellen moeilijk en gevoelig voor menselijke fouten. Om gemetastaseerde lasten beter te kwantificeren, beschrijven we het gebruik van Fiji-ImageJ voor een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Histopathologische analyse met hematoxylin en eosine (H&E) kleuring is een ander middel om longmetastasen te kwantificeren, en interessant is ook verbeterd met Fiji-ImageJ software6,7. Echter, omdat histopathologische analyse een enkel stukje van de long observeert, kan het onjuist en niet representatief zijn. Dit komt omdat het 4T1-model verschillende uitgezaaide laesies door het hele orgaan veroorzaakt die niet gelijkmatig verdeeld zijn. Hoewel de algemene trends tussen histopathologische analyse en handmatig tellen vergelijkbaar kunnen zijn8, kunnen de individuele waarden verschillen en mag histopathologische analyse daarom niet worden gebruikt als enig kwantificeringsmiddel. We tonen het voordeel ten opzichte van histopathologische analyse en de inconsistenties in handmatig tellen tussen verschillende tellers, terwijl ook de consistentie van het gebruik van Fiji-ImageJ aantoont. Bovendien tonen we aan dat deze methode de incubatietijd kan verminderen van 10-14 dagen tot 5 dagen, wat betekent dat onderzoekers gegevens uit hun studie veel eerder kunnen analyseren dan wanneer ze vertrouwen op handmatig tellen.
Deze methode is een verzameling eenvoudige aanpassingen aan het Pulaski en Ostrand-Rosenberg protocol3. Omdat het 4T1-model veel wordt gebruikt en omdat longmetastase een kritieke parameter is om te meten in preklinische modellen, geloven we dat deze methode op grote schaal kan worden gebruikt en zeer waardevol is voor borstkankeronderzoekers. De enige extra benodigdheden die nodig zijn een camera en toegang tot een computer met Fiji-ImageJ, een gratis software die vaak wordt gebruikt in beeldanalyse9. Deze methode richt zich specifiek op longmetastase, maar het kan worden gebruikt voor andere weefsels met een aanzienlijke uitgezaaide last.

<table><tbody><tr><td>Anesthesie kamer</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling</td></tr><tr><td>Verdovingsmiddel</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling</td></tr><tr><td>BALB/c vrouwelijke muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Blunt schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Rekenmachine</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td>Minimaal 8 megapixels</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td>Moet in staat zijn om 125 x g en 300 x g te bereiken</td></tr><tr><td>CO2 euthanasie-opstelling</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling</td></tr><tr><td>Koude ruimte, koelkast, koude opslag</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Computer met Fiji-ImageJ</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td>Moet in staat zijn om Fiji-ImageJ uit te voeren</td></tr><tr><td>Telkamer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische weegschaal</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum (FBS)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>IJs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Zie opmerkingen</td><td>Moet in staat zijn om 5% CO2 en 37 &deg;C te bereiken</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Pins of naalden</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td>Voor het vastpinnen van muizen tijdens necropsie</td></tr><tr><td>Kunststof schuifmaten</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Rotator of roterend wiel</td><td>Elk</td><td>Elk</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Steriele wegwerpfilter met PES-membraan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Flessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Flessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Driehoekige plastic beker</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Wordt gebruikt om muizen te wegen</td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Type IV collageenaase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm weefselkwekerijplaten</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifugebuisjes</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>10 cm weefselkwekerijplaten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>12 wel plaat</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugeerbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco's Fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1X Hank&rsquo;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 inch naalden</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&shy;2539&trade;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifugeerbuis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Thioguanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;M celstrainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Verdun tot 70% met DI water</td></tr></tbody></table>

computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4t1 breast cancer model te verbeteren

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Borstkanker is een verwoestende maligniteit, goed voor 40.000 vrouwelijke sterfgevallen en 30% van de nieuwe vrouwelijke kankerdiagnoses in de Verenigde Staten alleen al in 2019. De belangrijkste oorzaak van borstkanker gerelateerde sterfgevallen is de uitgezaaide last. Daarom moeten preklinische modellen voor borstkanker gemetastaseerde belasting analyseren om klinisch relevant te zijn. Het 4T1 borstkankermodel biedt een spontaan metastaserend, kwantificeerbaar muismodel voor stadium IV borstkanker bij de mens. Echter, de meeste 4T1 protocollen kwantificeren de uitgezaaide last door handmatig te tellen gekleurde kolonies op weefselkweek platen. Hoewel dit voldoende is voor weefsels met een lagere uitgezaaide belasting, veroorzaakt menselijke fout in handmatig tellen inconsistente en variabele resultaten wanneer platen samenvloeiend en moeilijk te tellen zijn. Deze methode biedt een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Hier evalueren we het protocol met behulp van de long, een zeer uitgezaaid weefsel in het 4T1-model. Afbeeldingen van methyleen blauw bevlekte platen worden verworven en geüpload voor analyse in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bepaalt vervolgens het percentage van het geselecteerde gebied van de afbeelding dat blauw is, wat het percentage van de plaat met uitgezaaide last vertegenwoordigt. Deze computergebaseerde aanpak biedt consistentere en snellere resultaten dan handmatig tellen of histopathologische evaluatie voor zeer uitgezaaide weefsels. De consistentie van fiji-ImageJ resultaten hangt af van de kwaliteit van het beeld. Kleine variaties in de resultaten tussen beelden kunnen optreden, dus het wordt aanbevolen dat meerdere beelden worden genomen en resultaten gemiddeld. Ondanks de minimale beperkingen is deze methode een verbetering van het kwantificeren van uitgezaaide belasting in de longen door consistente en snelle resultaten te bieden.

Deze methode bevat eenvoudige aanpassingen van het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg 4T1-protocol3 en kan worden gevisualiseerd in figuur 1. Wanneer 3 afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde gemetastaseerde kolonies voor 12 longplaten (1:10 verdunning), de resultaten waren zeer inconsistent tussen de verschillende tellers (Figuur 2A). Alle onderzoekers werden gericht om "tellen de gemetastaseerde kolonies die verschijnen als blau...

We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Dit protocol kwantificeert longmetastase, dat is een agressieve en veel voorkomende oorzaak van borstkanker gerelateerde dood, met verhoogde precisie en efficiëntie in een preklinische borstkanker model. In vergelijking met de oorspronkelijke techniek, dit protocol geeft onderzoekers snellere, meer consistente resultaten. Het verlicht de fout bij het tellen van mensen door gebruiksvriendelijke computertechnologie.Deze techniek kan absoluut worden uitgebreid tot preklinisch onderzoek naar de effecten van borstkankertherapieën op longmetastase door onderzoekers toe te staan een verminderde uitgezaaide last aan te tonen na een succesvolle behandeling. Begin met het labelen van een 15 milliliter conische buis voor het weefselmonster. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het collagenasemengsel van het type vier en 30 eenheden elastase toe aan de buis.Verplaats de long naar een schone 1X HBSS goed en wervel het met tangen om het resterende bloed te verwijderen, dan overbrengen naar een lege 3,5 centimeter weefsel kweekplaat. Hak de long met een schaar, spoel de plaat met 2,5 milliliter HBSS en breng de HBSS met de longstukken in een bereide 15 milliliter conische buis met de collagenase en elastase cocktail. Broed de buis gedurende 75 minuten bij vier graden Celsius op een tuimelschakelaar of roterend wiel.Ondertussen, label een 50 milliliter centrifuge buis en een 10 centimeter weefsel cultuur plaat voor elke muis. Als het doen van een verdunning, etiket genoeg weefsel kweekplaten voor de verdunningen. Breng het volume van de buis tot 10 milliliter met 1X HBSS en giet de inhoud vervolgens over een 70 micrometer celzeef in de 50 milliliter conische buis.Gebruik de zuiger van een een milliliter spuit om het monster voorzichtig te malen door de zeef. Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 350 keer G en gooi de supernatant weg en was de pellet twee keer met 10 milliliter 1X HBSS. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 60 micromolar 6-thioguanine volledige cultuur media, en plaat de monsters in de 10 centimeter celkweek platen met behulp van een verdunningsschema indien gewenst.Broed de platen vijf dagen lang in op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Giet cultuurmedia van de platen in de aangewezen afvalcontainer. Om de cellen te bevestigen, voeg vijf milliliter onverdunde methanol aan elke plaat en uitbroeden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.Giet de methanol van de platen in de juiste afvalcontainer en spoel vervolgens elke plaat af met vijf milliliter gedestilleerd water. Voeg vijf milliliter 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed het vijf minuten bij kamertemperatuur uit, zodat de methyleenblauwe oplossing zo wordt gewerveld dat de hele plaat bedekt. Giet het methyleenblauw in de juiste afvalcontainer en spoel elke plaat opnieuw af met vijf milliliter gedestilleerd water.Draai de plaat ondersteboven en dep het tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Leg de plaat op het deksel en laat het 's nachts drogen. Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn.Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd. Verwijder de gelabelde deksels van de platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Zet alle gekleurde longplaten op een schoon, licht oppervlak.Maak een foto van de verzameling platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren. Reflecties in de platen beïnvloeden de beeldanalyse en moeten worden vermeden. Besteed veel aandacht aan de genomen foto's, en neem verschillende foto's vanuit verschillende hoeken.Na het fotograferen van de platen, bijsnijden van de afbeelding om de deksels of iets op de achtergrond uit te sluiten. Open de afbeelding in Fiji ImageJ en wijzig deze in zwart-wit door op afbeelding, aanpassing en kleurdrempel te klikken. Selecteer vervolgens standaard voor drempelmethode, zwart-wit voor drempelkleur en lab voor kleurruimte.Controleer of het donkere achtergrondvak niet is geselecteerd. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.Gebruik het gereedschap Cirkel om het te analyseren gebied te selecteren. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen dat elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt.De grootte wordt weergegeven op de werkbalk terwijl deze wordt getekend. Analyseer de geselecteerde cirkel om het percentage wit te bepalen. Klik op analyseren en analyseren van deeltjes, selecteer vervolgens nul tot oneindig voor grootte, nul tegen een voor circulariteit, en niets voor show.Controleer het samengevatte vakje en druk op oke. Verplaats de cirkel naar de volgende plaat in de afbeelding door het midden te grijpen en de analyse te herhalen. Kopieer en plak het resultaat in een spreadsheet.Het percentagegebied, het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is, vertegenwoordigt de uitgezaaide last. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het percentage gebied resultaten tussen verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te beperken. Fiji ImageJ analyse werd vergeleken met handmatig tellen en histopathologische analyse.Toen drie afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde uitgezaaide kolonies, de resultaten waren inconsistent tussen tellers. Fiji ImageJ resultaten waren consistent tussen tellers voor elk van de drie beelden. De resultaten van de drie beelden en de drie tellers werden voor elke longplaat gecombineerd.De resultaten werden gemiddeld voor elke plaat om rekening te houden met de variaties tussen de beelden, die consistente resultaten tussen tellers. Bij het rangschikken van de platen van de meeste tot minst gemetastaseren, handmatig tellen overeengekomen op de meest confluente plaat, maar alle volgende rangen waren inconsistent. De rangen van de gemiddelde Fiji ImageJ resultaten waren veel meer consistent tussen tellers.Om het belang aan te tonen van het vermijden van reflecties in de beelden, wordt een beeld met de reflectie van een hand en de daaropvolgende Fiji ImageJ-analyse getoond, samen met een afbeelding van dezelfde plaat zonder reflectie. Donkere vlekken van een vuil achtergrondoppervlak of een bloedmonster residu op de platen kan ook een negatieve invloed Fiji ImageJ analyse. Deze bloedplaat heeft slechts twee uitgezaaide kolonies, maar het donkere residu veroorzaakt Fiji ImageJ te beschouwen als 31,6%uitgezaaid.Bij het proberen van dit protocol, vergeet niet om zorgvuldig te onderzoeken foto's voor reflectie, gebruik maken van dezelfde grootte cirkel voor elke plaat in de afbeelding, en de gemiddelde resultaten voor elke plaat tussen ten minste drie afzonderlijke beelden.

using-computer-based-image-analysis-to-improve-quantification-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

In dit protocol beschrijven we het gebruik van [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissie tomografie en computertomografie (18F-FDG PET/CT) denkbaar voor het meten van de tumor metabole respons op de gerichte therapie MLN0128 in een  Kras/Lkb1 mutant muis model van longkanker en gekoppelde imaging met hoge resolutie ex vivo autoradiografie en kwantitatieve histologie.

Met behulp van 18F-FDG PET/CT beeldvorming en kwantitatieve histologie voor het meten van dynamische veranderingen in het Glucose metabolisme in muismodellen van longkanker

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer longmetastase kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met computerondersteunde beeldanalyse via Fiji-ImageJ. Deze methode vermindert menselijke tel fouten en versnelt onderzoek naar borstkankertherapieën.

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Meer video's verkennen