Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren
2 oktober 2020
We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.
Dit protocol kwantificeert longmetastase, dat is een agressieve en veel voorkomende oorzaak van borstkanker gerelateerde dood, met verhoogde precisie en efficiëntie in een preklinische borstkanker model. In vergelijking met de oorspronkelijke techniek, dit protocol geeft onderzoekers snellere, meer consistente resultaten. Het verlicht de fout bij het tellen van mensen door gebruiksvriendelijke computertechnologie.
Deze techniek kan absoluut worden uitgebreid tot preklinisch onderzoek naar de effecten van borstkankertherapieën op longmetastase door onderzoekers toe te staan een verminderde uitgezaaide last aan te tonen na een succesvolle behandeling. Begin met het labelen van een 15 milliliter conische buis voor het weefselmonster. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het collagenasemengsel van het type vier en 30 eenheden elastase toe aan de buis.
Verplaats de long naar een schone 1X HBSS goed en wervel het met tangen om het resterende bloed te verwijderen, dan overbrengen naar een lege 3,5 centimeter weefsel kweekplaat. Hak de long met een schaar, spoel de plaat met 2,5 milliliter HBSS en breng de HBSS met de longstukken in een bereide 15 milliliter conische buis met de collagenase en elastase cocktail. Broed de buis gedurende 75 minuten bij vier graden Celsius op een tuimelschakelaar of roterend wiel.
Ondertussen, label een 50 milliliter centrifuge buis en een 10 centimeter weefsel cultuur plaat voor elke muis. Als het doen van een verdunning, etiket genoeg weefsel kweekplaten voor de verdunningen. Breng het volume van de buis tot 10 milliliter met 1X HBSS en giet de inhoud vervolgens over een 70 micrometer celzeef in de 50 milliliter conische buis.
Gebruik de zuiger van een een milliliter spuit om het monster voorzichtig te malen door de zeef. Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 350 keer G en gooi de supernatant weg en was de pellet twee keer met 10 milliliter 1X HBSS. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 60 micromolar 6-thioguanine volledige cultuur media, en plaat de monsters in de 10 centimeter celkweek platen met behulp van een verdunningsschema indien gewenst.
Broed de platen vijf dagen lang in op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Giet cultuurmedia van de platen in de aangewezen afvalcontainer. Om de cellen te bevestigen, voeg vijf milliliter onverdunde methanol aan elke plaat en uitbroeden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.
Giet de methanol van de platen in de juiste afvalcontainer en spoel vervolgens elke plaat af met vijf milliliter gedestilleerd water. Voeg vijf milliliter 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed het vijf minuten bij kamertemperatuur uit, zodat de methyleenblauwe oplossing zo wordt gewerveld dat de hele plaat bedekt. Giet het methyleenblauw in de juiste afvalcontainer en spoel elke plaat opnieuw af met vijf milliliter gedestilleerd water.
Draai de plaat ondersteboven en dep het tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Leg de plaat op het deksel en laat het 's nachts drogen. Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn.
Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd. Verwijder de gelabelde deksels van de platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Zet alle gekleurde longplaten op een schoon, licht oppervlak.
Maak een foto van de verzameling platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren. Reflecties in de platen beïnvloeden de beeldanalyse en moeten worden vermeden. Besteed veel aandacht aan de genomen foto's, en neem verschillende foto's vanuit verschillende hoeken.
Na het fotograferen van de platen, bijsnijden van de afbeelding om de deksels of iets op de achtergrond uit te sluiten. Open de afbeelding in Fiji ImageJ en wijzig deze in zwart-wit door op afbeelding, aanpassing en kleurdrempel te klikken. Selecteer vervolgens standaard voor drempelmethode, zwart-wit voor drempelkleur en lab voor kleurruimte.
Controleer of het donkere achtergrondvak niet is geselecteerd. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.
Gebruik het gereedschap Cirkel om het te analyseren gebied te selecteren. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen dat elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt.
De grootte wordt weergegeven op de werkbalk terwijl deze wordt getekend. Analyseer de geselecteerde cirkel om het percentage wit te bepalen. Klik op analyseren en analyseren van deeltjes, selecteer vervolgens nul tot oneindig voor grootte, nul tegen een voor circulariteit, en niets voor show.
Controleer het samengevatte vakje en druk op oke. Verplaats de cirkel naar de volgende plaat in de afbeelding door het midden te grijpen en de analyse te herhalen. Kopieer en plak het resultaat in een spreadsheet.
Het percentagegebied, het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is, vertegenwoordigt de uitgezaaide last. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het percentage gebied resultaten tussen verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te beperken. Fiji ImageJ analyse werd vergeleken met handmatig tellen en histopathologische analyse.
Toen drie afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde uitgezaaide kolonies, de resultaten waren inconsistent tussen tellers. Fiji ImageJ resultaten waren consistent tussen tellers voor elk van de drie beelden. De resultaten van de drie beelden en de drie tellers werden voor elke longplaat gecombineerd.
De resultaten werden gemiddeld voor elke plaat om rekening te houden met de variaties tussen de beelden, die consistente resultaten tussen tellers. Bij het rangschikken van de platen van de meeste tot minst gemetastaseren, handmatig tellen overeengekomen op de meest confluente plaat, maar alle volgende rangen waren inconsistent. De rangen van de gemiddelde Fiji ImageJ resultaten waren veel meer consistent tussen tellers.
Om het belang aan te tonen van het vermijden van reflecties in de beelden, wordt een beeld met de reflectie van een hand en de daaropvolgende Fiji ImageJ-analyse getoond, samen met een afbeelding van dezelfde plaat zonder reflectie. Donkere vlekken van een vuil achtergrondoppervlak of een bloedmonster residu op de platen kan ook een negatieve invloed Fiji ImageJ analyse. Deze bloedplaat heeft slechts twee uitgezaaide kolonies, maar het donkere residu veroorzaakt Fiji ImageJ te beschouwen als 31,6%uitgezaaid.
Bij het proberen van dit protocol, vergeet niet om zorgvuldig te onderzoeken foto's voor reflectie, gebruik maken van dezelfde grootte cirkel voor elke plaat in de afbeelding, en de gemiddelde resultaten voor elke plaat tussen ten minste drie afzonderlijke beelden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol kwantificeert longmetastasen in een preklinisch borstkankermodel met verhoogde precisie en efficiëntie. Het levert snellere en consistentere resultaten op vergeleken met traditionele methoden, waarbij menselijke telfouten worden verminderd door gebruiksvriendelijke computertechnologie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Borstkankeronderzoek
- Kwantificering van metastasen
- Preklinische modellen
Achtergrond
- Longmetastasen zijn een veelvoorkomende doodsoorzaak bij borstkanker.
- Nauwkeurige kwantificering is essentieel voor het evalueren van de effectiviteit van de behandeling.
- Traditionele methoden kunnen menselijke fouten bij het tellen veroorzaken.
- Computergestuurde technieken kunnen de precisie verbeteren.
Doel van de studie
- Om een efficiëntere methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van longmetastasen.
- Om de consistentie van de resultaten over verschillende experimenten te verbeteren.
- Om onderzoek naar therapieën voor borstkanker te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het labelen van weefselmonsters in conische buizen.
- Het gebruik van een collagenase-mengsel en elastase voor de monsterbereiding.
- Het toepassen van Fiji-ImageJ voor beeldanalyse.
- Het vergelijken van resultaten met traditionele telmethoden.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe methode vertoont een verbeterde precisie bij het kwantificeren van metastase.
- Resultaten worden sneller verkregen dan met eerdere technieken.
- Verminderde menselijke fouten verbeteren de betrouwbaarheid van de gegevens.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse studies naar borstkanker.
Conclusies
- Deze methode verbetert de kwantificering van longmetastasen aanzienlijk.
- Het is een waardevol instrument voor onderzoekers die borstkankertherapieën bestuderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om de effecten van behandelingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige kwantificering van de metastatische last is cruciaal voor de preklinische evaluatie van therapieën tegen borstkanker, waarbij inconsistente handmatige tellingen variabiliteit introduceren diebehandelingseffecten maskeert. Deze computergestuurde beeldanalysemethode vergroot het voorspellende vertrouwen door menselijke fouten te verminderen en de reproduceerbaarheid in sterk metastatische weefsels, zoals de long, te verbeteren. Het ondersteunt go/no-go-beslissingen in vroege ontdekkingsfasen door gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten te leveren voor de beoordeling van het metastatische fenotype.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt objectieve toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door de longmetastatische last te kwantificeren als functionele maatstaf voor het metastatische potentieel.
- Operationele waarde: Vermindert inter-operatorvariabiliteit bij de kwantificering van metastasen, wat bijdraagt aan consistente targetvalidatie tussen verschillende onderzoeksteams.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in preklinische gegevens door tel-artefacten te minimaliseren die de interpretatie van het werkingsmechanisme kunnen misleiden.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (percentage gekleurd oppervlak) die geschikt zijn voor high-content screening van verbindingen die de metastatische kolonisatie beïnvloeden.
- Reproduceerbaarheid: Het middelen van meerdere beelden per monster vermindert variabiliteit in de beeldvorming, wat zorgt voor betrouwbare prestaties van de assay over verschillende platen en experimenten heen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met Fiji-ImageJ, een breed toegankelijk platform, waardoor implementatie in meerdere laboratoria mogelijk is zonder dat daarvoor gespecialiseerde instrumentatie nodig is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert direct stadium IV borstkankerlongmetastasen, waardoor een klinisch relevant systeem wordt geboden voor het evalueren van anti-metastatische therapieën.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt een naadloze overgang van ontdekking naar preklinische validatie door consistente metingen van de metastatische last te leveren.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt datagestuurde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare metrieken voor metastasereductie.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode wordt geïntegreerd in de discovery-workflow na in vivo modellering en weefselname, waardoor een kwantitatieve brug wordt geslagen tussen de fenotypische beoordeling van metastase en de daaropvolgende mechanistische of therapeutische evaluatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door kwantitatieve metastasegegevens te leveren die de impact van genetische of farmacologische interventies op metastatische verspreiding verduidelijken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, numerieke resultaten die een betrouwbare vergelijking van compound-effecten tussen behandelingsgroepen in metastasis-gerichte screens mogelijk maken.
- Analytics: Genereert op percentages gebaseerde metrieken die statistische vergelijking en normalisatie over verschillende experimentele condities faciliteren.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door klinisch relevante kwantificering van longmetastasen te bieden, wat bijdraagt aan beoordelingen van de therapeutische effectiviteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare imaging- en analysecapaciteit die toepasbaar is op meerdere metastasemodellen naast 4T1 longmetastase.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de kwantificering van metastasen door subjectieve telfouten te verminderen en de betrouwbaarheid van de gegevens te verbeteren.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer en consistentie door geautomatiseerde beeldanalyse, waardoor er minder tijd en arbeid nodig is in vergelijking met het handmatig tellen van koloniën.
- Strategische waarde: Maakt zekerder go/no-go-beslissingen mogelijk door reproduceerbare gegevens over de metastatische last te leveren, wat het aantal fout-positieve en fout-negatieve resultaten bij therapeutische screening vermindert.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door betrouwbare metastatische metrieken te genereren voor het prioriteren van kandidaten met werkelijke anti-metastatische activiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basisbekwaamheid in Fiji-ImageJ voor drempelwaardebehandeling van afbeeldingen en particle-analyse.
- Is afhankelijk van gestandaardiseerde beeldvormingscondities om reflecties en achtergrondartefacten die de nauwkeurigheid van de kwantificering beïnvloeden, te minimaliseren.
- Maakt meerdere beeldopnamen per monster noodzakelijk om resultaten te middelen en inter-beeldvariabiliteit te verminderen.
- Vertrouwt op consistente kleurings- en droogprotocollen om een uniform methyleenblauw-signaal over de platen te garanderen.
- Profiteert van gestandaardiseerde cirkelgrootten voor de selectie van regio's van belang (regions-of-interest) om de vergelijkbaarheid tussen monsters te behouden.
