Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Dit protocol kwantificeert longmetastase, dat is een agressieve en veel voorkomende oorzaak van borstkanker gerelateerde dood, met verhoogde precisie en efficiëntie in een preklinische borstkanker model. In vergelijking met de oorspronkelijke techniek, dit protocol geeft onderzoekers snellere, meer consistente resultaten. Het verlicht de fout bij het tellen van mensen door gebruiksvriendelijke computertechnologie.

Deze techniek kan absoluut worden uitgebreid tot preklinisch onderzoek naar de effecten van borstkankertherapieën op longmetastase door onderzoekers toe te staan een verminderde uitgezaaide last aan te tonen na een succesvolle behandeling. Begin met het labelen van een 15 milliliter conische buis voor het weefselmonster. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van het collagenasemengsel van het type vier en 30 eenheden elastase toe aan de buis.

Verplaats de long naar een schone 1X HBSS goed en wervel het met tangen om het resterende bloed te verwijderen, dan overbrengen naar een lege 3,5 centimeter weefsel kweekplaat. Hak de long met een schaar, spoel de plaat met 2,5 milliliter HBSS en breng de HBSS met de longstukken in een bereide 15 milliliter conische buis met de collagenase en elastase cocktail. Broed de buis gedurende 75 minuten bij vier graden Celsius op een tuimelschakelaar of roterend wiel.

Ondertussen, label een 50 milliliter centrifuge buis en een 10 centimeter weefsel cultuur plaat voor elke muis. Als het doen van een verdunning, etiket genoeg weefsel kweekplaten voor de verdunningen. Breng het volume van de buis tot 10 milliliter met 1X HBSS en giet de inhoud vervolgens over een 70 micrometer celzeef in de 50 milliliter conische buis.

Gebruik de zuiger van een een milliliter spuit om het monster voorzichtig te malen door de zeef. Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 350 keer G en gooi de supernatant weg en was de pellet twee keer met 10 milliliter 1X HBSS. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 60 micromolar 6-thioguanine volledige cultuur media, en plaat de monsters in de 10 centimeter celkweek platen met behulp van een verdunningsschema indien gewenst.

Broed de platen vijf dagen lang in op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Giet cultuurmedia van de platen in de aangewezen afvalcontainer. Om de cellen te bevestigen, voeg vijf milliliter onverdunde methanol aan elke plaat en uitbroeden gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat de methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.

Giet de methanol van de platen in de juiste afvalcontainer en spoel vervolgens elke plaat af met vijf milliliter gedestilleerd water. Voeg vijf milliliter 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed het vijf minuten bij kamertemperatuur uit, zodat de methyleenblauwe oplossing zo wordt gewerveld dat de hele plaat bedekt. Giet het methyleenblauw in de juiste afvalcontainer en spoel elke plaat opnieuw af met vijf milliliter gedestilleerd water.

Draai de plaat ondersteboven en dep het tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Leg de plaat op het deksel en laat het 's nachts drogen. Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn.

Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor onbepaalde tijd. Verwijder de gelabelde deksels van de platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Zet alle gekleurde longplaten op een schoon, licht oppervlak.

Maak een foto van de verzameling platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren. Reflecties in de platen beïnvloeden de beeldanalyse en moeten worden vermeden. Besteed veel aandacht aan de genomen foto's, en neem verschillende foto's vanuit verschillende hoeken.

Na het fotograferen van de platen, bijsnijden van de afbeelding om de deksels of iets op de achtergrond uit te sluiten. Open de afbeelding in Fiji ImageJ en wijzig deze in zwart-wit door op afbeelding, aanpassing en kleurdrempel te klikken. Selecteer vervolgens standaard voor drempelmethode, zwart-wit voor drempelkleur en lab voor kleurruimte.

Controleer of het donkere achtergrondvak niet is geselecteerd. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.

Gebruik het gereedschap Cirkel om het te analyseren gebied te selecteren. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen dat elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt.

De grootte wordt weergegeven op de werkbalk terwijl deze wordt getekend. Analyseer de geselecteerde cirkel om het percentage wit te bepalen. Klik op analyseren en analyseren van deeltjes, selecteer vervolgens nul tot oneindig voor grootte, nul tegen een voor circulariteit, en niets voor show.

Controleer het samengevatte vakje en druk op oke. Verplaats de cirkel naar de volgende plaat in de afbeelding door het midden te grijpen en de analyse te herhalen. Kopieer en plak het resultaat in een spreadsheet.

Het percentagegebied, het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is, vertegenwoordigt de uitgezaaide last. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het percentage gebied resultaten tussen verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te beperken. Fiji ImageJ analyse werd vergeleken met handmatig tellen en histopathologische analyse.

Toen drie afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde uitgezaaide kolonies, de resultaten waren inconsistent tussen tellers. Fiji ImageJ resultaten waren consistent tussen tellers voor elk van de drie beelden. De resultaten van de drie beelden en de drie tellers werden voor elke longplaat gecombineerd.

De resultaten werden gemiddeld voor elke plaat om rekening te houden met de variaties tussen de beelden, die consistente resultaten tussen tellers. Bij het rangschikken van de platen van de meeste tot minst gemetastaseren, handmatig tellen overeengekomen op de meest confluente plaat, maar alle volgende rangen waren inconsistent. De rangen van de gemiddelde Fiji ImageJ resultaten waren veel meer consistent tussen tellers.

Om het belang aan te tonen van het vermijden van reflecties in de beelden, wordt een beeld met de reflectie van een hand en de daaropvolgende Fiji ImageJ-analyse getoond, samen met een afbeelding van dezelfde plaat zonder reflectie. Donkere vlekken van een vuil achtergrondoppervlak of een bloedmonster residu op de platen kan ook een negatieve invloed Fiji ImageJ analyse. Deze bloedplaat heeft slechts twee uitgezaaide kolonies, maar het donkere residu veroorzaakt Fiji ImageJ te beschouwen als 31,6%uitgezaaid.

Bij het proberen van dit protocol, vergeet niet om zorgvuldig te onderzoeken foto's voor reflectie, gebruik maken van dezelfde grootte cirkel voor elke plaat in de afbeelding, en de gemiddelde resultaten voor elke plaat tussen ten minste drie afzonderlijke beelden.