Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwit-eiwit interacties door het mogelijk maken van de detectie van nieuwe bindende partners voor extracellulaire eiwitten, zowel in hoge doorvoer en met een hoge gevoeligheid. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat u met slechts een paar microgram eiwit honderden dia's genereren met behulp van de micro-arrayprinter. Gebruik een standaard microarrayer voor diaafdrukken.

Dit instrument heeft een capaciteit van 57 dia's per run, maakt gebruik van een printkop met 48 spotpennen en biedt plaats aan maximaal 8.000 plekken per dia. Genereer werkende platen met behulp van 384 putplaten bij 10 microliter monster per put uit de voorraadplaten. Voer deze stap handmatig uit, voordat u diaafdrukken met de microarrayer.

Spot vervolgens eiwitten met quilltype die pinnen op epoxy silaneglijbanen met een luchtvochtigheid van 60% spot om uitdroging van de eiwitvlekken te voorkomen. Cy3 gelabeld runder serum albumine kan worden gespot in tweevoud tussen elk eiwit monster om de array te visualiseren voor masker montage. Verwijder na het afdrukken de eiwitmicroarraydia's uit de bevochtigde omgeving.

Gebruik vervolgens een ultrasone mister om een fijne mist van blokkerende oplossing te genereren die zich op het diaoppervlak nestelt. Blokkeer vervolgens de dia's 's nachts met 5% melk in PBST om het oppervlak te activeren. Bewaar dia's met min 20 graden Celsius in 50%glycerol om bevriezing te voorkomen.

Interacties tussen extracellulaire eiwitten worden vaak gekenmerkt door hun lage affiniteiten. Om de detectie van deze interacties mogelijk te maken, door het verhogen van de bindende avidity, ontwikkelden we een multivalente aanpak op basis van het vastleggen van het gevraagde eiwit uitgedrukt als FC gelabelde extracellulaire domeinen op eiwit A gecoate micro kralen. Spin de drager IgG, die is gelabeld met Cy5 mono reactieve kleurstof zoals beschreven in de tekst protocol.

Om de molaire verhouding van het query-eiwit en Cy5 IgG te berekenen, verdeelt u het moleculaire gewicht van het queryeiwit door het moleculaire gewicht van de IgG en vermenigvuldigt u met 40 microgram per milliliter om de concentratie van Cy5 IgG te bepalen. Zodra alle verhoudingen zijn bepaald vormen de micro kraal eiwit complex door het combineren van de FC gelabelde query en de Cy5 IgG met het eiwit A micro kralen. Meng de vering in PBS op een buis rotator gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Om te beginnen met de screening, verwarm de voorbereide glijbanen bij kamertemperatuur voordat u op het hybridisatiestation laadt. Om de screening uit te voeren, eerst wassen van de micro-array met PBST voor een minuut om resterende glycerol te verwijderen. Laad 200 microliter van één milligram per milliliter eiwit A in PBS 5% melk en incubbate gedurende 30 minuten om te voorkomen dat onvercomplexe eiwitten Een microkraal bindt aan FC-gelabelde eiwitten die in de microarray aanwezig kunnen zijn.

Na de hybridisatie station wast de dia's met PBST, belasting 200 microliter van de query micro kraal complex, in aanwezigheid van een milligram per milliliter eiwit A en incubaat gedurende 30 minuten. Na hybridisatie en het wassen van de glijbanen door het hybridisatiestation, spoel glijbanen met water en plaats ze in individuele 50 milliliter conische buizen. Droog de buizen door vijf minuten op 900 keer G te draaien.

Ten slotte, scan de dia's met een micro-array scanner geschikt om Cy3 en Cy5 fluorescentie te detecteren door spannend op 532 en 635 nanometer, respectievelijk. Hier wordt een representatieve afbeelding van een afgedrukte dia weergegeven. De Cy3 gelabelde runderserum albumin spots zijn in het groen.

De spots werden in tweevoud afgedrukt als kwaliteitscontrole van het drukproces. Representatieve resultaten van een weeseiwit, gescreend op identificatie van bindende partners met behulp van de extracellulaire eiwitmicroarraytechnologie, worden hier getoond. De dubbele rode vlekken worden geïdentificeerd als een hit voor de gescreende query eiwit.

Deze methode die wordt beschreven is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor het afdrukken van een gamma van eiwitbibliotheken, of het nu gaat om specifieke eiwitfamilies of grote compilaties van eiwitten zoals het onze. Elk eiwit van belang kan worden geëvalueerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om de dia's met zorg te behandelen en ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen om het verlies van activiteit van de gedrukte eiwitten te voorkomen.

Na het scherm van een eiwit van belang, is het sterk aangeraden om eventuele hits waargenomen door het gebruik van orthogonale technologieën, zoals oppervlakteplasmon resonantie verder te valideren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om extracellulaire eiwitinteracties bij de mens te bestuderen.