Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Dit is een gedetailleerd protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de Yeast MoClo kit. Deze methode maakt het gemakkelijk klonen van een verscheidenheid aan multi-gen klasgenoten mogelijk. Het is ideaal voor het genereren van een grote bibliotheek met gerelateerde onderdelen.

Begin met het opzetten van de Golden Gate reactiemix. Voeg 20 femtomoles toe van elk PCR-product en de entryvector, één microliter van 10X T4 Ligase buffer, 0,5 microliter Esp3I en 0,5 microliter T4 ligase. Voeg dubbel gedestilleerd water toe om het totale volume op 10 microliter te brengen.

Voer vervolgens de kloonreactie uit. Transformeer de gehele reactiemix in de DH5 alfastam of gelijkwaardige Escherichia coli chemisch competente cellen door hitteschok. Verdeel de cellen over een lb-plaat met 35 microgram per milliliter chlooramfenicol.

Incubeer het bord vervolgens 's nachts op 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur het bord uit de incubator en laat het ongeveer vijf uur op vier graden Celsius staan om het superfoldergroene fluorescerende eiwit of sfGFP te laten ontwikkelen voor een intensere groene kleur. Om de plaat te screenen, plaatst u deze op een ultra-violette of blauwe lichttransilluminator.

De sfGFP die kolonies bevat, fluoresceert onder het UV-licht. De groene kolonies zijn negatief omdat ze het ongesneden deel plasmide bevatten. De witte kolonies zijn waarschijnlijk positief.

Het klonen is succesvol als er 30 tot 100% witte kolonies zijn. Monteer een tussenvector met de linker connector, de sfGFP dropout, de rechter connector, een gist selectie marker, een gist oorsprong van replicatie, en het deel plasmide met een mRFP1, een E.coli oorsprong, en het ampicilline resistente gen. Voer de kloonreactie uit zoals beschreven in het teksthandschrift.

Zet de hele reactiemix om in de DH5-alfastam en verdeel de cellen vervolgens over een lb-plaat met 50 microgram per milliliter carbenicilline of ampicilline. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur de plaat uit de incubator.

De plaat bevat zowel lichtrode als lichtgroene kolonies. Houd het ongeveer vijf uur op vier graden Celsius om de mRFP1 en sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de groene kolonies te identificeren die de potentieel correcte tussenvector bevatten.

Streep de groene kolonies uit op een lb carbenicillineplaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Streep ze de volgende dag weer uit op een chlooramfenicolplaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. De kolonies die groeien op chlooramfenicolplaten bevatten verkeerd samengestelde plasmiden.

Zodra de tussenvector met succes is geassembleerd, gaat u verder met het assembleren van de transcriptie-eenheden. Deze vierdelige assemblage bevat de tussenliggende vector, een promotor, een CDS en determinator. Zuiver de plasmiden, noteer hun concentraties en verdun elke plasmide tot 20 femtomoles DNA per microliter.

Na het uitvoeren van de kloonreactie, transformeer de volledige kloonreactiemix in de DH5 alfa of gelijkwaardige E.coli competente cellen en plate ze op LBN carbenicillin. Incubeer het bord vervolgens 's nachts op 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur de plaat uit de incubator en houd deze ongeveer vijf uur op vier graden Celsius om de sfGFP te laten rijpen.

Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de niet-fluorescerende witte kolonies te identificeren die de mogelijk correcte transcriptie-eenheden bevatten. Stel een tussenvector samen voor de multi-gen plasmiden zoals beschreven in het teksthandschrift. Transformeer vervolgens de hele kloonreactiemix in DH5-alfacellen en leg ze op lb met 50 microgram per milliliter kanamycine.

Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Voer rode en groene kleurgebaseerde screening uit, streep en kweek de groene kolonies op een lb kanamycine-plaat om te screenen op misassemblages zoals eerder aangetoond. Verzamel vervolgens de multi-gen plasmide door een kloonreactie op te zetten zoals beschreven in het teksthandschrift.

Transformeer de hele kloonreactiemix in DH5-alfacellen en leg ze op lb kanamycine. Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Voer vervolgens de groen-witte screening uit zoals eerder beschreven.

Dit protocol werd gebruikt om één integratieve multi-gen plasmide te construeren voor het verstoren van de ADE2 locus. Vier replicerende en één integratieve multi-gen plasmiden werden geassembleerd. De verhouding van potentieel correcte kolonies voor het tussenliggende vector klonen was 1,83%Zodra de intermediaire plasmide was gekloond, was het slagingspercentage van het assembleren van multi-gen plasmiden uit het intermediair 93,77%Het verwaarloosbare aantal positieve witte kolonies toont een suboptimale assemblage van multi-gen plasmiden aan.

Na omzetting in gist groeiden kolonies die bètacaroteen en lycopeen produceerden op dag drie. Vier kolonies van elke plaat werden op verse borden uitgestreept en nog twee dagen gekweekt. De carotenoïden werden geëxtraheerd en gekwantificeerd door UV-Vis spectrofotometrie.

BTS1/ERG20 leidt tot een 35-voudig hogere productie van bètacaroteen in vergelijking met de stam met ALLEEN ERG20. Evenzo is de productie van lycopeen ongeveer 16,5 keer hoger in de stam met BTS1/ERG20 in vergelijking met ERG20 alleen. De multi-gen integratieve plasmide werd gebruikt voor de verstoring van de ADE2 locus, hetzij met een gRNA en geen helper DNA of met gRNA en een multi-gen integratieve plasmide als helper DNA.

Na drie tot vier dagen werden rode kolonies waargenomen op de YPD-plaat met Nourseothricin, wat aangeeft dat ADE2 met succes was verstoord. Tijdens het proberen van deze methode is het belangrijkste om te onthouden om de DNA-concentraties nauwkeurig te meten en zorgvuldig te pipetten tijdens het opzetten van deze reactiemix. Deze techniek stelt onderzoekers op het gebied van Yeast Metabolic Engineering in staat om een groot aantal genen en promotors te onderzoeken voor een maximale productopbrengst.