Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

Het bacteriële CRISPR-Cas9-systeem heeft de experimentele mogelijkheden voor levenswetenschappers aanzienlijk vergroot. Verschillende CRISPR-benaderingen zijn echter afhankelijk van de gelijktijdige levering van meerdere geleide-RNAs in afzonderlijke cellen. String assemblage gRNA klonen maakt het mogelijk de eenvoudige en snelle generatie van multiplex gRNA expressie vectoren in een enkele kloon stap.

Maar STAgR is niet alleen eenvoudig, het is ook efficiënt, goedkoop en gemakkelijk aan te passen. Om te beginnen, voeg de N20 gRNA sequenties aan de voorwaartse versterking primers voor STAgR DNA string als uitsteeklengten. Voeg sense gRNA sequenties vijf prime aan de voorwaartse primer, Scaffold forward primer, voor een conventionele steiger, of sam vooruit primer voor een MS2-bevattende steiger.

Voeg vervolgens de omgekeerde aanvulling N20 gRNA sequenties toe aan de reverse primer sequenties, waarbij RP primers worden gekozen, afhankelijk van de specifieke promotors en snaren die worden gebruikt. Om te beginnen met het genereren van de individuele klonen fragmenten voor Gibson Assembly, overdracht 10 microliter van de high-fidelity buffer naar een buis. Voeg een microliter van 10 milimolar dPP's en 0,25 microliter van beide 100 micromolar overhang primers.

Voeg 10 nanogram van de DNA-sjabloontekenreeks of vector toe en 1,5 microliter DMSO. Voeg voldoende water toe om het uiteindelijke volume op 49,5 microliter te brengen en voeg vervolgens 0,5 microliter HF polymerase toe. Broed de reacties op een thermocycler, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Neem hierna een 5,5 microliter aliquot uit de PCR-reactie. Voeg lading kleurstof aan alle aliquots, en laad het op een 1%agarose gel. Laad een geschikte DNA-ladder voor het dimensioneren en voer de gel in een geschikte gel-running buffer op 120 volt gedurende 30 minuten.

Terwijl de gel draait, voeg vijf microliters van de buffer voorzien van de beperking enzym, en 0,5 microliters DpnI aan de resterende 44,5 microliters van vector PCR reactie om resterende plasmide sjabloon gebruikt tijdens de PCR te verwijderen. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Controleer of de amplicons de juiste maat hebben.

Om te beginnen MET DNA-zuivering, voeg 1,8 microliter magnetische kralen per een microliter van PCR-product, en meng door pipetting op en neer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Met behulp van een magneet, scheiden de kralen in DNA-fragmenten van de resterende vloeistof.

Spoel de pellet af met 70% ethanol zonder deze volledig opnieuw uit te hangen, om de kralen te wassen. Herhaal deze wasbeurt nog een extra keer. Verwijder met behulp van een pipet alle ethanol en laat de pelletlucht drogen.

Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter water toe en pipet op en neer om de pellet te mengen en op te lossen. Gebruik een magneet om de kralen van de vloeistof te scheiden. Breng de heldere supernatant naar een nieuwe buis.

Gebruik hierna een spectrofotometer om de DNA-concentraties te bepalen. Bereid eerst de 5x isothermale reactiebuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer voor de Gibson Assembly Master Mix 320 microliter van de 5x isothermale reactiebuffer met 697 microliter water.

Voeg 3 microliter T5 exonuclease, 20 microliter DNA polymerase en 160 mciroliters van Taq DNA ligase toe. Breng 7,5 microliter van de Assembly Master Mix over op een verse buis. Voeg vervolgens 2,5 microliter invoegtoepassing in vector toe, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Incubeer de monsters op 50 graden Celsius gedurende 45 tot 60 minuten. Daarna, bewaar monsters op ijs, of op 20 graden Celsius, voor latere transformatie. Wanneer klaar om de bacteriën te transformeren, dooi chemisch competente TOP10 E.Coli bacteriën op ijs.

Voeg vervolgens vijf microliter van de Gibson Mix toe aan 50 microliter van competente bacteriën en meng door zachtjes op de onderkant van de buis te vegen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Plaats de buis in een 42 graden Celsius waterbad of warmteblok gedurende 45 seconden om de bacteriën te verwarmen.

Zet vervolgens de buizen weer in het ijs. Voeg 250 microliters soc medium aan de bacteriën, en laat ze herstellen bij 37 graden Celsius in een schudden incubator voor 30 tot 45 minuten. Nadat de bacteriën zijn hersteld, plaat ze op 1,5%LB Agar platen die 100 microgram per milliliter ampicilline bevatten.

Broed de platen 's nachts op 37 graden Celsius. Om te beginnen, bereiden ten minste twee sets van 200 microliter PCR reactiebuizen voor elke constructie. Vul een van de sets reactiebuizen met 100 microliters LB medium, met 100 microgram per milliliter ampicilline.

Met behulp van een steriele pipettip, krassen uit het biologische materiaal van een bacteriële kolonie, en verspreid het op de bodem van een lege 200 microliter PCR reactiebuis. Breng de pipettip onmiddellijk over naar de tweede overeenkomstige reactiebuis die LB-medium bevat. Draai de tip rond om ervoor te zorgen dat sommige van de bacteriën worden overgebracht naar de LB media.

Incubeer bij 37 graden Celsius voor later gebruik. Bereid vervolgens 10 microliter pcr-mastermix per reactiebuis voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 10 microliter van de PCR Master Mix toe aan de gelabelde PCR-reactiebuizen, zonder de LB-media.

Met behulp van een thermocycler, inculuberen de reacties zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg hierna laadkleurstof toe aan de versterkte fragmenten en laad ze op een 1%agarose gel. Laad een geschikte DNA-ladder voor het dimensioneren en voer de gel in een geschikte gel-running buffer op 120 volt gedurende 30 minuten.

Bereken de theoretische grootte van de amplicon door de individuele maten van gebruikte promotors, gRNA-steigers en het aantal N20-sequenties op te voegen. Aan de resultaten van de kolonie PCR worden de bacteriële klonen geïdentificeerd op basis van de juiste bandgrootte en of ze waarschijnlijk de juiste vectoren zullen herbergen. Met behulp van de overeenkomstige 100 microliter cultuur, inenten een 2,5 milliliter 's nachts LB cultuur met 100 microgram per milliliter ampicilline.

Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 12 uur. Gebruik vervolgens een commerciële plasmid mini-kit om de plasmide DNA te extraheren, volgens de instructies van de fabrikant. In deze procedure wordt snaarassemblage gRNA-klonen gebruikt om snel gRNA-expressieplasmiden te genereren.

Een typisch resultaat van de PCR's gebruikt om de STAgR stukken te verkrijgen is hier te zien. De zes amplicons vertegenwoordigen lineaire DNA-stukken, elk met de individuele gRNA N20 sequenties op hun uiteinden. De plasmide backbone wordt uitgebreid met de targeting sequenties van gRNA1 en gRNA6, en bezit daarom de vereiste overlappingen tot twee andere PCRs voor Gibson Assembly.

Na zuivering kan een DNA-opbrengst van ten minste één microgram voor vectoren en wisselplaten worden bereikt. Na Gibson Assembly resulteert bacteriële transformatie in 100 tot 700 bacteriële kolonies. Representatieve analyse van 22 bacteriële kolonies, via kolonie PCR volgens een STAgR protocol met zes gRNA cassettes, geeft aan dat zeven klonen de verwachte amplicon grootte voor volledige assemblage tonen.

De andere klonen ontvingen waarschijnlijk STAgR vectoren, die één tot vijf gRNA cassettes bevatten, terwijl één kloon volledig leeg is. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in een paar uur. Goed uitgevoerd, het maakt het mogelijk de generatie van een veelheid van multiplex gRNA expressie vectoren in minder dan een werkweek.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om aandacht te besteden aan de juiste toewijzen en combinatie van N20 overhang primers. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben over hoe u uw eigen multiplex gids RNA expressie vectoren te maken.