Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Deze methode maakt gebruik van de verschillende manieren om de recombinante virale eiwitexpressie-uitdagingen aan te pakken met behulp van een viraal eiwit P'als chaperonne voor een ander viraal eiwit N'om RNA-vrije N-eiwitten te verkrijgen. Het RNA-vrije RSV N-eiwit wordt verkregen voordat het virusspecifieke RNA in nucleocapsid in vitro wordt geassemblaged. De methode kan ook worden gebruikt met andere niet-gesegmenteerde negatieve zin RNA virussen.

De ligatie onafhankelijke kloonmethode is een snelle techniek voor het verwerven van co-expressie constructies. Waarom of electieven vlek elektronenmicroscoop is een snelle methode voor het controleren van grote assembleren in ruwe cel. We willen je twee tips geven.

Krijg eerst een hoge opbrengst en solide resultaten voor elke stap voordat u naar de volgende stap gaat. Ten tweede, stel de juiste programma's in voor chromatografie en oefen het oppakken van rasters met een tang. Voor bi-cistronic constructie van de N en P co-expressie, kweek vier een liter culturen van E coli BL21DE3 stamcellen in LB medium bij 37 graden Celsius.

Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,6 bereikt, verlaagt u de temperatuur tot 16 graden Celsius. Induceer na een uur eiwitexpressie door behandeling met 0,5 millimol IPTG 's nachts. Verzamel de volgende ochtend de cellen door centrifugeren en resuspend de pellets in 200 milliliter lysisbuffer.

lyse de cellen door sonicatie gedurende 15 minuten, met drie seconden aan, drie seconden uit pulsen. En verzamel de lysaten door centrifugeren. Laad het supernatant in een kobaltzwaartekolom van 2,5 bij 10 centimeter, met ongeveer 10 milliliter kralen.

Vooraf geëquilibreerd met 5 tot 10 kolomvolumes lysisbuffer. En was de kolom met vijf kolomvolumes van buffer B en vijf volumes buffer C.Gebruik twee volumes buffer D om het eiwit uit de kralen te elute. En equilibreer de Q-kolom met vijf hoeveelheden QA-buffer van één milliliter.

Gebruik een peristaltische pomp om het verdunde monster op de kolom te laden. Smelt de geladen Q-kolom op de HPLC-machine, samen met nieuwe QA- en QB-buffers. Voer de pompwas uit om de machine met succes te wassen met één tot twee volumes QB- en QA-buffers.

Stel na de laatste wasbeurt het debiet in op één milliliter per minuut en stel UV1 in op 280 nanometer en UV2 op 260 nanometer, met behulp van een 96 diepe putplaat om de fracties te verzamelen. Gebruik vervolgens een stapsgewijze gradiënttoepassing van drie tot vier volumes van elke concentratie elutiemiddel om de eiwitten te eluteren, beginnend bij een QB-concentratie van 0% en het percentage elke keer met 5% verhogen. Het N-0 P eiwitcomplex zal bij de 15%QB bufferconcentratie elute.

Isoleer het eiwit door gelfiltratie, in een kleinschalige zuiveringskolom van één bij 30 centimeter, geëquilibreerd met buffer E.Analyseer vervolgens het eiwit dat fracties bevat per SDS-pagina. Voor virusspecifieke nucleocapsid assemblage, meng en incubeer het gezuiverde N-0 P complex met RNA oligo in een moleculaire verhouding van 1:1,5 bij kamertemperatuur gedurende een uur. Voor-equilibrate een kleinschalige zuivering gel filtratie kolom met buffer E.And verwijder eventuele neerslag door centrifugeren.

Laad het supernatant in de kolom grootte-uitsluitingschromatografie. En vergelijk de grootte uitsluiting chromatografie beelden van het eiwit met RNA assemblage, en eiwit alleen controle monsters, het combineren van de nucleïnezuur zuiverheidsverhoudingen, om te bepalen welke pieken zijn de geassembleerde N RNA, N-0 P en vrije RNA. Om een N RNA-complex samen te stellen, verzamelt u alle N RNA-piekfracties, voert u een RNA-extractie uit en voert u een ureumpaginagel uit om de lengte van het specifieke RNA te controleren.

Om een negatief vlekraster voor negatieve vlek elektronenmicroscopie te bereiden, gebruik een warmteplaat om 5 ml dubbel gedestilleerd water te verwarmen tot koken en voeg 37,5 milligram uranylformaat toe aan het water om een 0,75% uranyl formate kleuroplossing te verkrijgen. Breng de oplossing over op een met aluminiumfolie bedekt bekerglas. En voeg vier microliters van 10 molaire natriumhydroxide toe.

Na 15 minuten roeren beschermd tegen licht, filtert u de oplossing door een 0,22 micron filter in een reageerbuis. Om de continue koolstof gecoate elektronenmicroscopieroosters hydrofiel te maken, plaatst u de roosters in een kamer die is aangesloten op een voeding en past u negatief geladen ionen toe op de roosters. Knip en vouw een twee bij twee inch parafilm strip.

Voeg twee druppels gedestilleerd water van 40 microliter toe aan het ene uiteinde van de strip. En twee 40 microliter druppels van 0,75% uranyl formate kleuroplossing aan de andere kant. Voeg drie microliters eiwitmonster toe aan elk raster.

Blokkeer na één minuut de roosters tegen opblazend papier en dompel de roosters twee keer in de gedestilleerde waterdruppels. En eenmaal in de eerste kleuringsoplossing druppel. Dompel vervolgens het rooster gedurende 30 seconden onder in de druppel van de tweede kleuringsoplossing, voordat u de roosters tegen vloeipapier blaast om overtollige vlekkenoplossing te verwijderen en de roosters aan de lucht te laten drogen voordat ze worden gebeelddrukt.

Met behulp van dit protocol kan een grootschalig oplosbaar hetero dimerisch respiratoir syncytieel virus N0 P-complex worden verkregen. In E coli wordt de volledige lengte van N- en N-terminale porties van de P-eiwitten samen uitgedrukt met een 10 X Zijn tag op het N-eiwit. Op basis van de UV-absorptie nucleïnezuurzuiverheidsverhouding bevatte N0 P zowel de volledige lengte N- als N-terminal P, maar bevatte geen cellulair RNA.

De gezuiverde N0 P kan vervolgens worden gestimuleerd en geassembleerd tot nucleocapsid-achtige deeltjes op elektronenmicroscopieroosters via incubatie met specifieke RNA-oligo's zoals aangetoond. Vermijd bij het zuiveren van het eiwit luchtbellen tijdens de kolomzuivering en verdun het monster met QA-buffer om de pH- en zoutconcentratie aan te passen voordat u het monster op de kolom laadt. Zorg ervoor dat u de elektronenmicroscopieroosters aan de buitenrand vasthoudt om te voorkomen dat de roosters vervuilen.

Dit zal ons helpen om de niet-positieve RSV genoomverpakkingsvragen te bepalen, of het nu linkshandig of rechtshandige spiraalvormige structuur is. Volgens deze procedures en authentiek kan een RNA-sjabloon voor de RSV-polymeraseactiviteitstest worden uitgevoerd. En deze RSV virale specifieke nucleocapsid kan worden gebruikt voor de hoge resolutie cryo EM analyse.