Name: Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Leer hoe je infectieuze virusdeeltjes redt uit gekloonde cDNA van positief-streng RNA-virussen zoals Japans encefalitisvirus. Deze methode maakt genetische manipulatie en vaccinontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de Utah Science Technology and Research-fonds graag erkennen voor de steun aan YML en de Korea National Research Foundation-subsidies (2009-0069679 en 2010-0010154) voor de steun aan SIY. Dit onderzoek werd ondersteund door de Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, en goedgekeurd als tijdschriftartikel nummer UAES #8753. Ook danken de auteurs Dr. Deborah McClellan voor redactionele assistentie.

De auteurs hebben verklaard dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het huidige protocol is met succes gebruikt om full-length infectieuze cDNA-klonen van twee verschillende stammen (CNU / LP2 SA 27 en 14 -14-2 28) van JEV, een flavivirus waarvan de functionele cDNA bleek inherent moeilijk samen te stellen is en genereren propageren vanwege toxiciteit gastheercel en de genetische instabiliteit van gekloneerde cDNA 8,74-76 Dit protocol omvat drie hoofdcomponenten. eerste, het maximaliseren van de synthese / amplificatie van cDNA een getrouwe kopie van het virale RNA met behulp van high-fidelity reverse transcriptase / DNA polymerase; tweede, het kloneren van de virale prM-E coderend gebied dat toxische sequenties (ongepubliceerde gegevens) 74,77,78 in een zeer lage kopieaantal vector BAC uit de oorspronkelijke cDNA subkloneren tot de uiteindelijke volledige lengte cDNA montagestappen; en de derde, gebruik van een kloneringsvector die BAC kan een vreemd DNA met een gemiddelde grootte van 120-350 kb, 19-21 die blijkbaar tolereert grotere DNA inserts dan andere kloneringsvectoren. Deze klonering wordt algemeen toepasbaar op vele andere positieve streng RNA-virussen, met name die met een groot RNA-genoom van ~ 10 tot 32 kb. Genereren van een infectieuze cDNA-kloon is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een reverse genetics voor RNA-virussen, met name positieve streng RNA-virussen, omdat het genoom treedt virale mRNA dat vertaald in eiwitten door gastheercel ribosomen. Aldus kan virale replicatie worden gestart door de introductie van een cDNA-afgeleide genoom-lengte RNA molecuul in een vatbare gastheercel. De beschikbaarheid van een infectieus JEV cDNA-kloon, in combinatie met recombinant DNA-technologie, heeft ons begrip van verschillende aspecten van de virale levenscyclus verhoogd op moleculair niveau, zoals genexpressie 73,79 en genoomreplicatie. 63,64 ook een full-length JEV cDNA-kloon blijkt een waardevol instrument voor de ontwikkeling van antivirale vaccins 28 en gentherapie vectoren. &lt;sup&gt; 80,81 Zoals bij alle positieve streng RNA virussen er meerdere kritische stappen bij het ​​construeren van een betrouwbare functionele cDNA voor JEV waaruit zeer besmettelijke RNAs kunnen worden gesynthetiseerd in vitro. Idealiter zou de sequentie van de synthetische RNA getranscribeerd van een kloon van volledige lengte cDNA identiek zijn aan die van het virale genomische RNA, met name de 5&#39;- en 3&#39;-terminale sequenties die nodig zijn voor de initiatie van virale RNA replicatie . 60-62 In het huidige protocol, de authentieke 5&#39;- en 3&#39;-uiteinden werden verzekerd door het plaatsen van de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de eerste adenine nucleotide van het virale genoom en positioneren van een unieke kunstmatige XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van de laatste thymine nucleotide van het virale genoom, respectievelijk. Capped synthetische RNAs met authentieke 5 &#39;en 3&#39; uiteinden werden geproduceerd door run-off transcriptie van een XbaI-gelineariseerd en MBN behandelde cDNA template gebruik SP6 RNA polymerase geprimed met m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Dop analoog. Dit protocol kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Voor in vitro transcriptie kan een bacteriofaag RNA-polymerase (bijvoorbeeld T3 of T7) worden gebruikt in combinatie met een goed gedefinieerde promotorsequentie. 27 als run-off site, kan een andere restrictieplaats worden toegepast als het niet presenteren het virale genoom en als synthetische RNA van de gelineariseerde cDNA eindigt met de authentieke 3 &#39;uiteinde. Het belang van het 3&#39;-uiteinde nucleotidesequentie werd aangetoond door een ~ 10-voudige afname in infectiviteit RNA wanneer een synthetisch RNA bevat drie of vier-verbonden-virus nucleotiden aan het 3 &#39;uiteinde. 27 In een in vitro transcriptie reactie, zowel de m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A en m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G cap analoog kan evengoed gebruikt, hoewel deze plaatsen een ongerelateerde extra G nucleotide stroomopwaarts van het virale 5 &#39;-end, maar datBovendien neemt niet weg infectiviteit of replicatie van synthetisch RNA. 27 Bovendien is het verwijderen van de matrijs cDNA van het RNA transcripten met DNase I digestie is niet noodzakelijk RNA infectiviteit testen, omdat de cDNA sjabloon zelf is niet besmettelijk. 27 De BAC-technologie is nu toegepast op de bouw van infectueuze cDNA-klonen voor een handvol positieve streng RNA-virussen, namelijk twee JEVs, CNU / LP2 27 en SA 14 -14-2 28 (genoomgrootte, ~ 11 kb); twee dengue virussen, BR / 90, 26 en NGC 29 (~ 11 kb); het bovine virale diarree virus, SD1 (~ 12 kb), 25 twee klassieke varkenspest virussen, C en Paderborn (~ 12 kb), 24 de border disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 de overdraagbare gastro-enteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 de feline infectieuze peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 het Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 het Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 en het menselijk coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Het belangrijkste voordeel van het gebruik van BAC&#39;s voor cDNA constructie is het hoge genetische stabiliteit van de grote, 1- of 2-kopie plasmiden BAC.; De intrinsieke aard van zijn extreem lage aantal kopieën is ook een groot nadeel, omdat zeer lage opbrengsten van BAC DNA en de daaruit voortvloeiende verlaging van de zuiverheid van het BAC DNA opzichte van chromosomaal DNA gastheer. In het huidige protocol is de opbrengst van BAC DNA gemaximaliseerd door groeiende E. coli DH10B getransformeerd met de besmettelijke BAC pBAC / SA 14 -14-2 in een voedselrijke medium, 2xYT. Dit neemt de gemiddelde opbrengst slechts ~ 15 pg BAC DNA van 500 ml 2xYT bouillon. Tevens is de zuiverheid van het BAC DNA best bereikt door CsCl-dichtheidsgradiënt centrifugatie EtBr voor zuiveringIn plaats van de gebruikelijke kolommen gebaseerde plasmide-isolatie. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de BAC-getransformeerde E. coli mag niet overwoekeren, omdat het de genetische stabiliteit van het gekloonde cDNA in gevaar kan brengen, en een hogere groei leidt niet noodzakelijk tot een grotere opbrengst of hogere zuiverheid BAC DNA. De hier beschreven protocol is een geoptimaliseerde, efficiënte en gestroomlijnde werkwijze voor de constructie en vermeerdering van een genetisch stabiele full-length infectueuze cDNA-kloon als een BAC voor JEV, een procedure ooit gedacht praktisch onmogelijk. Dezelfde klonen strategie kan ook worden toegepast op vele andere positieve streng RNA virussen. In het algemeen infectieuze cDNA-klonen kunnen wij verschillende mutaties (bijvoorbeeld deleties, inserties en puntmutaties) introduceren in een viraal RNA-genoom van hun biologische functies te bestuderen virale replicatie en pathogenese. Deze cDNA-gebaseerde reverse genetics systeem maakt het mogelijk om de ontwikkeling en test vaccins en therapeutische kandidaten richten een virulentiefactor (en) van een bepaalde positieve streng RNA-virus van belang. Bovendien kan deze infectieuze cDNA techniek ook worden gebruikt als een virale vector, in staat is tot expressie van een vreemd gen (en) van belang voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.

Voor RNA virologen de komst van recombinant DNA technologie in de late jaren 1970 maakte het mogelijk om virale RNA-genomen om te zetten in cDNA-klonen, die vervolgens kan worden vermeerderd zoals plasmiden in bacteriën voor de genetische manipulatie van RNA-virussen. 1 het eerste RNA-virus te zijn moleculair gekloond was bacteriofaag Qp, een positieve streng RNA virus dat Escherichia coli infecteert. Een plasmide dat een volledige cDNA kopie van de Qp-genoom RNA leidde tot infectieuze fagen QP wanneer ingebracht in E. coli. 2 Kort daarna deze techniek werd toegepast op poliovirus, een positieve streng RNA-virus van mens en dier. Een plasmide dat een cDNA van volledige lengte van het poliovirus genomische RNA infectieus wanneer getransfecteerd in zoogdiercellen en staat de productie van infectieuze virions 3 In deze &quot;-DNA geïntroduceerd&quot; werd de gekloneerde cDNAs moeten intracellulair getranscribeerd virale RNA replicatie te initiëren.;het is echter onduidelijk hoe de transcriptie wordt geïnitieerd en hoe de transcripten worden verwerkt om de juiste virale sequentie. Deze bezorgdheid heeft geleid tot de ontwikkeling van een alternatieve &quot;-RNA gestart&quot; benadering, waarbij een volledige cDNA-kopie van het virale RNA-genoom is gekloneerd onder een promoter herkend door een E. coli of faag RNA-polymerase voor het produceren van synthetische RNA&#39;s in vitro met gedefinieerde 5 &#39;en 3&#39; uiteinden, waarbij de volledige virale replicatiecyclus ondergaan wanneer ingebracht in gastheercellen. 4,5 Het eerste succes van deze benadering werd gerapporteerd brome mosaic virus 6,7 een positieve streng RNA-virus van planten. Sindsdien is de RNA-gelanceerd aanpak ontwikkeld voor een breed scala aan positieve streng RNA-virussen, waaronder calicivirussen, alfavirussen, flavivirussen, arterivirussen en coronavirussen. 1,4,5,8 In zowel de DNA- en RNA-gelanceerde reverse genetics systemen, de bouw van een vl-cDNA-kloon is de sleutel tot het genereren van infectieus DNA of RNA van positieve streng RNA virussen, maar het wordt een aanzienlijke technische uitdaging als de grootte van het virale genoom toeneemt. 17/09 met name een groot RNA-genoom van ~ 10 -32 kb bevat drie belangrijke obstakels voor het klonen van een full-length cDNA functioneel. 18 Het eerste probleem is de synthese van een cDNA getrouwe kopie, aangezien de betrouwbaarheid van RT-PCR is omgekeerd evenredig met de lengte van het virale RNA. De tweede hindernis is de aanwezigheid van potentieel toxische sequenties, al lang RNA moleculen vaker onverwachte sequenties die in staat is de cDNA-fragment in onstabiele plasmiden in E. bevatten coli. De derde en meest kritische punt is de beschikbaarheid van een geschikte vector, aangezien het moeilijk is een kloneringsvector die een virale cDNA-insert van&gt; 10 kb kunnen onderbrengen vinden. In de afgelopen drie decennia hebben deze barrières overwonnen door een aantal ontwikkelingen in de enzymologie, methodologie, eend vectorology. 1,4,5,8 Van deze, de meest veelbelovende en innovatieve ontwikkeling is het klonen van grote positieve streng RNA-virussen zoals besmettelijke bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC). De BAC vector is een low-copy klonen plasmide (1-2 kopieën / cel) op basis van de E. coli vruchtbaarheid factor, met een gemiddelde grootte van insert DNA ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment wordt in de BAC vector op een gelijkaardige manier ingevoegd kloneren in algemene kloneringsvectoren.; de verkregen BAC klonen stabiel gedurende vele generaties E. coli. 22,23 Tot op heden heeft het RCB technologie gebruikt van infectieuze cDNA-klonen voor&gt; 10 leden van drie positieve streng RNA virus families, namelijk Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 en Coronaviridae creëren. 9,16,17 , 31,32 Met behulp van Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, dit werk rapporteert de gedetailleerde procedures die kunnen wordengebruikt om een ​​genetisch stabiele full-length infectieuze BAC voor verschillende positieve streng RNA-virussen te construeren. JEV is een zoönotische flavivirus 33 die in de natuur tussen vogels, varkens en andere gewervelde gastheer wordt overgebracht door muggen vectoren. 34,35 Bij mensen JEV infectie kan het ernstige vaak dodelijke neurologische ziekte Japanse encefalitis (JE), 36 die optreedt in Azië en delen van de westelijke Stille Oceaan, 37,38 met een geschatte jaarlijkse incidentie van ~ 50,000-175,000 klinische gevallen. 39,40 Het genoom van JEV is een ~ 11-kb, enkelstrengs, positieve-sense RNA-molecuul en bestaat uit een enkel open leesraam (ORF) geflankeerd door twee niet-coderende regio (NCR) van het 5 &#39;en 3&#39; uiteinden. 41,42 Het ORF codeert voor een polyproteïne dat wordt gesplitst door gastheer en virale proteases tot 10 afzonderlijke eiwitten genereren aangewezen C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 in de N- naar C-terminus. 34,43,44 Ook eXtended vorm van NS1 (NS1) wordt door -1 ribosomale frameshifting uitgedrukt in codons 8-9 van NS2A. 45,46 Van deze 11 eiwitten, de drie structurele eiwitten (C, prM en E) zijn essentieel voor de vorming van infectieuze virions, 47,48 en de resterende acht structurele eiwitten (NS1 tot NS5 en NS1 &quot;) zijn noodzakelijk voor virale RNA-replicatie, 49-51 deeltje assemblage, 52-56 en aangeboren immuniteit fraude. 57-59 zowel de 5 &#39;en 3 &#39;NCRs bevatten geconserveerde primaire sequenties en vorm RNA secundaire / tertiaire structuren, 60-62 die belangrijk zijn voor het moduleren van viraal RNA replicatie. 63,64 Dit protocol beschrijft de gereedschappen, werkwijzen en strategieën voor het genereren van een full-length infectieuze BAC van JEV SA 14 -14-2. 28 Deze functionele BAC kloon bevat een volledig cDNA kopie van het RNA genoom JEV, 65 die is omgeven door een promoter de SP6 RNA polymerase upstreamvan de virale 5&#39;-uiteinde en een unieke XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van het virale 3&#39;-end in vitro run-off transcriptie. Deze BAC technologie is toepasbaar op het construeren van een volledig functionele cDNA-kloon moleculaire voor een serie van positieve streng RNA virussen.

<table><tbody><tr><td>1. Moleculaire Kloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactief</td></tr><tr><td>50 ml Buis</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Fles</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Laag Smeltpunt)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>DE-81 Filterpapier</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toxisch en zeer mutageen</td></tr><tr><td>Filterkolom (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Glazuur Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Irriteerbaar</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hoog-getrouwe DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Naald (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biogevaarlijk (Scherp afval)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligonucleotide Synthese</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenol (Buffer-verzadigd)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxisch en zeer corrosief</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxisch en zeer corrosief</td></tr><tr><td>Fenol:Guanidine Isothiocyanaat</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxisch, corrosief en irriterend</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Acetaat</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Versluitbare Polypropyleen Buis (16 &times; 76 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Acetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Dodecyl Sulfaat</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spinkolom (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (gist)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>2. Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essentieel Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Conische Buis (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Violet&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschaal (150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvet (2-mm Gap)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxisch en kankerverwekkend</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essentieel Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-

bacteriële kunstmatige chromosomen: een functional genomics tool voor de studie van positive-streng rna-virussen

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetica, een aanpak om infectieus virus volledig te redden van een gekloonde cDNA, heeft het veld van positieve-streng RNA-virussen, waarvan de genomen dezelfde polariteit hebben als cellulair mRNA, gerevolutioneerd. Het op cDNA gebaseerde reverse genetica-systeem is een baanbrekende methode die directe manipulatie van de virale genomische RNA mogelijk maakt, waardoor recombinante virussen worden gegenereerd voor moleculaire en genetische studies van zowel virale RNA-elementen als genproducten in virale replicatie en pathogenese. Het biedt ook een waardevolle platform die de ontwikkeling van genetisch gedefinieerde vaccins en virale vectoren voor de levering van vreemde genen mogelijk maakt. Voor veel positieve-streng RNA-virussen zoals Japanse encefalitis virus (JEV) zijn de gekloonde cDNA's echter onstabiel, wat een groot obstakel vormt voor de constructie en propagatie van het functionele cDNA. Hier beschrijft het huidige rapport de strategische overwegingen bij het creëren en amplificeren van een genetisch stabiele volledige infectieuze JEV cDNA als een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) met behulp van de volgende algemene experimentele procedures: virale RNA-isolatie, cDNA-synthese, cDNA subcloning en modificatie, samenstelling van een volledige cDNA, cDNA linearisatie, in vitro RNA-synthese en virus herstel. Dit protocol biedt een algemene methodologie die van toepassing is op het klonen van volledige cDNA voor een reeks positieve-streng RNA-virussen, met name die met een genoom van >10 kb in lengte, in een BAC-vector, waaruit infectieuze RNA's in vitro kunnen worden getranscribeerd met een bacteriofagen RNA-polymerase.

Voor alle positieve streng RNA-virussen, de betrouwbaarheid en efficiëntie van reverse genetics systeem afhankelijk van de genetische stabiliteit van een gekloneerde cDNA van volledige lengte, waarvan de sequentie overeenkomt met de consensus sequentie van viraal genoom RNA. 27 Figuur 1 toont een vijf- stap strategie voor de constructie van een full-length infectieus cDNA als een BAC voor JEV SA 14 -14-2 28: Stap 1, zuivering van viraal RNA uit de celkweek supernatant van JEV geïnfecteerde BHK-21-cellen (Figuur 1A); Stap 2 synthese van vier overlappende cDNA-amplicons (F1 tot F4) verspreid over de hele virale genoom (Figuur 1B); Stap 3, subkloneren van elk van de vier aangrenzende cDNA fragmenten in een BAC vector creëren pBAC / F1 tot pBAC / F4 (figuur 1C); Stap 4, wijziging van de gekloneerde cDNA&#39;s in vitro run-off transcriptie met SP6 RNA polymerase, dat wil zeggen, het plaatsen van een SP6promoter sequentie direct stroomopwaarts van de virale 5&#39;-uiteinde (pBAC / F1 SP6), waardoor een bestaand inwendige XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), en invoegen een nieuwe kunstmatige XbaI- run-off site onmiddellijk stroomafwaarts van het virale 3&#39;-end (pBAC / F4 RO) (figuur 1D); en stap 5, samenstel van een full-length SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figuur 1E) tabel. 1 worden de oligonucleotiden in deze kloneringswerkwijze. 28 Voor de constructie van een functionele JEV cDNA, de eerste belangrijke stap is de synthese van de vier overlappende cDNA-fragmenten met gezuiverde virale RNA als een matrijs voor RT-PCR. Figuur 2 geeft een representatief resultaat voor de vier RT-PCR producten die werden geëlektroforeerd op een 0,8%agarosegel. Deze gel blijkt duidelijk dat een full-length JEV cDNA wordt geamplificeerd in vier overlappende cDNA-fragmenten. Soms kan RT-PCR reacties op één of meer additionele virus-specifieke of niet-specifieke producten die meestal kleiner is dan het verwachte product, vanwege de niet-specifieke hybridisatie van de primers tijdens cDNA-synthese / amplificatie. Anderzijds, weinig of geen verwachte RT-PCR produkt zou worden versterkt door RNase toevallige besmetting tijdens het virale RNA isolatie of onjuist RT-PCR prestaties. De volgende belangrijke stap is het kloneren en aanpassen van een partiële of volledige lengte JEV cDNA in BAC, wat een relatief eenvoudige procedure die standaard recombinant DNA technieken gebruikt. 69 Figuur 3 toont een representatief resultaat voor de zuivering van de BAC kloon die een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2 door strepen in een CsCl-EtBr verloop.In dit experiment werd na centrifugatie gedurende 16 uur bij 401.700 x g, twee verschillende banden, dat wil zeggen, de E. coli chromosomaal DNA boven en sterk gedraaide BAC plasmide-DNA hieronder, zijn zichtbaar in het midden van de buis onder langgolvig ultraviolet licht. Een minimale volume (~ 400 ul) van de onderste BAC DNA-band werd zorgvuldig verzameld door prikken van een gat met een spuit op de zijkant van de buis. Vervolgens de EtBr werd uit de BAC DNA door butanolextractie en de EtBr vrije BAC DNA werd geconcentreerd door ethanolprecipitatie. De laatste stap is het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA&#39;s in vitro getranscribeerd vanaf de full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) na RNA-transfectie in gevoelige cellen (Figuur 4). Deze stap omvat drie opeenvolgende stappen: Stap 1, linearisatie van de full-length SA 14 -14-2 cDNA aan het 3&#39;-einde van het virale genoom (Figuur 4A); Stap 2, de productie van synthetische RNA&#39;s van de gelineariseerde cDNA door de run-off transcriptie (Figuur 4B); en stap 3, redding van de recombinante virussen in BHK-21-cellen getransfecteerd met de synthetische RNA&#39;s (figuur 4C). Experimenteel twee onafhankelijke klonen van pBAC / SA 14 -14-2 werden gelineariseerd met XbaI digestie en behandeld met MBN de vier basen 5 &#39;overhang die door het XbaI-digestie verwijderd. De gelineariseerde BACs werden gereinigd door fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie. De linearisatie van de twee gezuiverde BACs werd gedemonstreerd op een 0,8% agarosegel (Figuur 5A). De fenol-chloroform extractie moet zorgvuldig gebeuren zodat het gelineariseerde BACs zijn RNase-free. Beide gelineariseerde BACs diende als een template voor cDNA run-off transcriptie met behulp SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 &#39;) ppp (5) Dop analoog. De integriteit van de synthetische RNA&#39;s werd aangetoond door het uitvoeren van aliquots van de twee transcriptie-reactiemengsels op een 0,6% agarose gel, samen met een referentie 1 kb DNA ladder (Figuur 5B). In deze eenvoudige bepaling, de belangrijkste prominente RNA band altijd slechts migreerde onder de 3 kb DNA-band en leek scherp te zijn. Echter, gedegradeerd RNA zou uitgesmeerd verschijning op dezelfde gel hebben. Een infectieuze center assay is de gouden standaard voor het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA&#39;s. Deze test werd uitgevoerd door electroporating BHK-21 cellen met RNA-monsters, zaaien gelijke hoeveelheden van de 10-voudig serieel verdund geëlektroporeerde cellen in 6-well platen met naïeve BHK-21 cellen (3 x 10 5 cellen / putje), en bedekken agarose op de cel monolagen. Na incubatie gedurende 4 dagen werden de overlevende cellen gefixeerd met formaldehyde en gekleurd met kristalviolet sPLOSSING het aantal infectieuze centra (plaques), dat overeenkomt met het aantal infectieuze RNA-moleculen afgegeven in de cellen (Figuur 6A) te kwantificeren. Aangezien de cDNA template voor in vitro transcriptie bewezen niet besmettelijk, werd 27 een hoeveelheid van de transcriptie reactiemengsel direct gebruikt voor elektroporatie. Elektroporatie is de voorkeurswerkwijze voor transfectie van RNA; Als alternatief kan RNA worden getransfecteerd met behulp van andere werkwijzen DEAE-dextran en kationische liposomen. RNA elektroporatie is zeer effectief, maar &quot;vonkontlading&quot; van de elektrische puls treedt zelden of zouten aanwezig in de elektroporatie reactie of de elektroporatie cuvette wordt hergebruikt zijn. De expressie van virale eiwitten in RNA-getransfecteerde cellen werd onderzocht door immunofluorescentie assays gebruik van een anti-NS1 konijnen antiserum (figuur 6B). De productie van virale deeltjes verzameld in de supernatanten van RNA-getransfecteerde cellen wasalyzed door plaque assays (figuur 6C). De resultaten van deze experimenten tonen duidelijk aan dat de cDNA-afgeleide synthetische RNA infectieus permissief BHK-21-cellen, het genereren van een hoge titer van recombinant virus. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequentie een (5 &#39;tot 3&#39;) </td><td> Stand b </td><td> Polariteit </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 22/01 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> Mierik voel </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Zin </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 14/01 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 17/01 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Zin </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td colspan="4"> een JEV sequenties worden weergegeven in hoofdletters, en BAC sequenties zijn aangegeven in kleine letters. b Nucleotide positie verwijst naar de volledige genoomsequentie van JEV SA 14 -14-2 (Genbank nummer JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Oligonucleotiden gebruikt voor cDNA-synthese, PCR-amplificatie en mutagenese BAC. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figuur 1.0, Strategie voor de constructie van een full-length cDNA van JEV SA 14 -14-2 als BAC (A) Isolatie van viraal RNA van JEV deeltjes.. Getoond is een schematisch diagram van het genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. (B) Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) voor de gehele virale genoom. (C) Subklonering van vier overlappende cDNA-fragmenten in een BAC vector, het creëren van pBAC / F1 aan pBAC / F4. (D) Wijziging van de gekloonde cDNA&#39;s voor run-off transcriptie in vitro. pBAC / F1 SP6 is een derivaat van pBAC / F1 de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de virale 5&#39;-uiteinde bevat. pBAC / F3 KO is een derivaat van pBAC / F3 die een stille puntmutatie (A 9134 → T, asterisk) bevat. pBAC / F4 RO is een derivaat van pBAC / F4 dat een kunstmatige XbaI afvloeiing stroomafwaarts van het virale 3&#39;-uiteinde bevat. (E </<html> strong&gt;) Vergadering van een full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figuur 2. Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) verspreid over de volledige lengte genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. De vier RT-PCR producten worden geëvalueerd door elektroforese in een 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De verwachte grootte van de vier cDNA-fragmenten worden aangegeven aan de onderkant van het beeld van de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Zuivering van de BAC met een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2. Is de BAC plasmide geïsoleerd uit E. coli DH10B door de SDS-alkalische lysismethode en verder gezuiverd door middel van strepen in een CsCl-EtBr verloop. Gepresenteerd is een voorbeeld van de CsCl-EtBr gradiënt met behulp van een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figuur 4. Overzicht van de terugwinning van infectieuze virussen uit een full-length JEV SA 14 -14-2 cDNA geassembleerd in een BAC. (A) Linearisatie van de cDNA template. De full-length JEV BAC wordt gesneden metXbaI en behandeld met MBN. (B) Bereiding van de RNA-transcripten. De gelineariseerde cDNA getranscribeerd door SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Dop analoog. (C) Herstel van de synthetische JEVs. De in vitro getranscribeerd RNA worden getransfecteerd in BHK-21 cellen door elektroporatie, die een hoge titer van synthetische virus genereert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figuur 5. Synthese van RNA van in vitro transcriptie met behulp van een full-length BAC JEV cDNA als matrijs. (A) Vorming van het gelineariseerde full-length JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Twee onafhankelijke klonen van pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 en Cl.2) worden gelineariseerd door digestie met XbaI en daaropvolgende behandeling met MBN. De gelineariseerde BACs worden onderzocht door elektroforese in een 0,8% agarosegel. (B) De productie van de synthetische RNA&#39;s door de run-off transcriptie. Beide gelineariseerde BACs wordt gebruikt als een matrijs voor SP6 RNA-polymerase run-off transcriptie. Porties van de twee transcriptie-reacties worden uitgevoerd op een 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figuur 6. Specifieke besmettelijkheid van de synthetische RNA getranscribeerd van een full-length JEV BAC en het herstel van de synthetische virus. BHK-21 cellen zijn mock-geëlektroporeerd (Mock) of geëlektroporeerd met de RNA-transcripten afgeleid frOM elk van de twee onafhankelijke klonen van de volledige lengte JEV BAC (Cl.1 en Cl.2). (A) RNA infectiviteit. De cellen bedekt met agarose en gekleurd met kristalviolet in 4 dagen na transfectie. RNA infectiviteit wordt bepaald door infectieuze midden assays voor de hoeveelheid infectieus RNA geëlektroporeerd in cellen (linker paneel) te schatten. Ook representatieve beelden van besmettelijke centra worden weergegeven (rechter paneel). (B) Eiwitexpressie. De cellen worden gekweekt in 4 putjes objectglaasjes kamer. Virale eiwitexpressie in RNA-geëlektroporeerde cellen op 20 uur na transfectie (HPT) wordt geanalyseerd door immunofluorescentie assays Een primair anti-NS1 konijnen antiserum en een secundair Cy3-geconjugeerd geiten anti-konijnen IgG (rood). De kernen worden tegengekleurd met 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). De immunofluorescentie beelden worden bedekt op de bijbehorende differentiële interferentie contrast beelden. (C) virusopbrengst. De cellen worden gekweekt in 150 mm cultuur gerechten. De productie van infectueuze virionen opgebouwd in de kweeksupernatanten van RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 HPT wordt onderzocht door plaque assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Het algemene doel van deze procedure is het redden van infectieuze virusdeeltjes die volledig zijn gemaakt van een gekloond cDNA van RNA-virussen met een positieve streng, waarvan de genomen dezelfde polariteit hebben als cellulair mRNA, zoals het Japanse encefalitisvirus. Deze op cDNA gebaseerde reverse genetica is een fundamentele methode die directe manipulatie van het virale genomische RNA mogelijk maakt, waardoor recombinante virussen kunnen worden gegenereerd voor moleculaire en genetische studie naar virale replicatie en pathogenese. Deze techniek biedt tevens een waardevol platform dat de ontwikkeling mogelijk maakt van genetisch gedefinieerde vaccinia-virale vectoren voor de aflevering van vreemde genen.Deze methoden zijn toepasbaar voor het klonen van cDNA over de volledige lengte voor negatieve of positieve stammen, RNA-virussen, in het bijzonder virussen met genomen groter dan 10 kb. De procedure zal worden gedemonstreerd door verschillende leden van mijn laboratorium: research assistent Sang-Im Yun, postdoctoral fellows Byung-Hak Song en Jin-Kyoung Kim en de bachelorstudent Jordan Frank.Het videogedeelte van deze publicatie behandelt de preparatie van het bacteriële kunstmatig chromosoom dat de sequenties van belang bevat, de synthese van RNA, getranscribeerd vanuit het back-plasmide, en hoe de infectiviteit van de RNA's en de virusopbrengst kunnen worden gemeten. Alle procedures die voorafgaan aan het genereren van het BAC-plasmide worden in detail beschreven in het tekstprotocol. Groei voor deze procedure eerst een enkele kolonie E. coli DH10B, die het BAC-plasmide draagt, in drie milliliter 2X YT-bouillon met chloramfenicol. Incubeer de cultuur gedurende 10 uur bij 35 °C met schudden op 225 tot 250 RPM.Schaal de kweek na 10 uur op. Inoculeer vervolgens 500 µL van de groeicultuur in 500 ml medium en kweek het inoculum zes uur lang onder krachtig schudden. Centrifugeer na zes uur de bacteriële kweek in twee flessen van 250 ml bij 3.100 g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspendeer vervolgens elke pellet in 30 ml GTE-oplossing.Voeg 500 microliters lysozym toe en incubeer de suspensies 10 minuten op ijs. Bereid ondertussen verse lysisoplossing voor de volgende stap. Voeg na 10 minuten 60 milliliters van de lysisoplossing toe en meng door te wervelen tot de oplossing helder is.Laat de reacties 10 minuten lang op kamertemperatuur verlopen. Voeg vervolgens 45 milliliter neutralisatieweloplossing toe aan elk flesje en keer de flesjes om tot ze grondig zijn gemengd. Plaats ze daarna 10 minuten op ijs.Verzamel de geneutraliseerde lysaten met behulp van gekoelde centrifugatie bij een hoog g-getal. Verzamel vervolgens de supernatanten in twee nieuwe flessen van 250 milliliter. Voeg aan elk volume 0,6 volumes 100% isopropanol toe en plaats deze gedurende 20 minuten op ijs.Centrifuge vervolgens de precipitaten, verwijder dan de supernatanten en los de pellets op in vijf milliliter TE-buffer. Voeg de twee volumes samen in één buis van 50 milliliter en precipiteer het RNA door een gelijk volume vijf molair lithiumchloride toe te voegen en het mengsel 10 minuten op ijs te incuberen. Gebruik een koude centrifugatie van 20 minuten om het RNA-precipitaat te verzamelen.Overbreng vervolgens de supernatant naar een nieuwe buis van 250 milliliter, voeg twee volumes 100% isopropanol toe en plaats de buis op ijs zodat het DNA-precipitaat zich kan vormen. Centrifugeer het precipitaat na 20 minuten, aspireer de supernatant, resuspendeer de DNA-pellet in 9,5 milliliter TE-buffer en overbreng de DNA-oplossing naar een buis van 50 milliliter.Zet de preparatie voort door een cesiumchloride-gradiënt met ethidiumbromide op te stellen. Breng het mengsel met een spuit met een 18 gauge naald over in een afsluitbare polypropyleenbuis en sluit de buis af. Centrifugeer de afgesloten buis gedurende de nacht in een ultracentrifuge om een cesiumchloride-gradiënt te vormen.Verzamel de volgende dag een DNA-band van het BAC-plasmide uit de cesiumchloridegradiënt. Gebruik een naald van 18 gauge om een ontluchtingsgat aan de bovenkant van de gradiënt te maken en een naald van 20 gauge met een spuit om het BAC-DNA aan de zijkant van de gradiënt te verzamelen; breng de verzamelde fractie vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Voer een wasstap uit door 2,5 volumes verzadigde butanol in water toe te voegen en meng dit door middel van normaal vortexen.Centrifugeer het mengsel vervolgens bij kamertemperatuur en breng de onderste waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Herhaal deze wasstap in totaal zes keer om al het ethidiumbromide te verwijderen. Precipiteer nu het BAC-DNA. Voeg een volume van een tiende drie molaire natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol toe aan de buis. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het precipitaat bij kamertemperatuur en was het DNA-pellet met één milliliter 70% ethanol. Herhaal het centrifugeren en verzamel het pellet opnieuw. Droog het gepelletteerde DNA ten slotte 10 minuten aan de lucht en elueer het in 200 microliters TE-buffer.Begin met een grootschalige restrictie-enzymvertering van het BAC-plasmide met Xba-one in een totaal volume van 100 µL. Voer deze vertering uit bij 37 °C gedurende 12 tot 15 uur. Incubeer de vertering vervolgens verder met nog eens 25 units mungboon-nuclease bij 30 °C gedurende twee uur.Vul na de incubatie het volume aan tot 300 µL met gedestilleerd water. Voer vervolgens een fenolextractie uit door een gelijk volume fenol-chloroform-isoamylalcohol aan het verdunde monster toe te voegen, het mengsel een minuut krachtig te vortexen, de buis te centrifugeren en de bovenste waterige fase over te brengen naar een nieuwe buis.Herhaal vervolgens de extractie met chloroform. Win daarna het gelineariseerde BAC-DNA terug door middel van ethanolprecipitatie. Verzamel de DNA-pellet via centrifugatie, verwijder het supernatant en was de pellet met één milliliter 70% ethanol. Herhaal de centrifugatiestap en laat de pellet aan de lucht drogen. Los de DNA-pellet na 10 minuten drogen op in 30 µL gedestilleerd water. Analyseer vervolgens één µL van het teruggewonnen BAC op een 0,8% agarosegel.Stel vervolgens een runoff-transcriptie van 25 µL op van het gelineariseerde BAC-DNA, inclusief getritieerd UTP voor RNA-kwantificering. Voer de reactie uit bij 37 °C gedurende een uur. Analyseer daarna één of twee µL van de runoff-transcriptiereactie op een 0,6% agarosegel.Begin met BHK-21-cellen die gedurende 24 uur zijn gekweekt in schalen van 150 millimeter met een platingdichtheid van 3 miljoen cellen per schaal. Spoel de cellaag met koude oplossing A en detach de cellen vervolgens door trypsinisatie. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 270 g gedurende twee minuten.Resuspendeer de cellen vervolgens in 50 milliliters koude oplossing A en centrifugeer ze opnieuw. Herhaal deze wasstap drie keer. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in oplossing A met een concentratie van 20 miljoen per milliliter. Meng daarna een aliquot van 400 microliter van de cel-suspensie met twee micrograms synthetisch RNA in een cuvet van twee millimeter.Elektroporeer het mengsel direct onder optimale omstandigheden en laat de cellen 10 minuten rusten. Breng de cellen vervolgens over naar een microcentrifugeebuisje met 600 µL compleet kweekmedium. Bereid nu een tienvoudige seriële verdunning van de geëlectroporeerde cellen in volumes van 1 mL. Plaat 100 µL aliquots van elke verdunning op monolagen van normale BHK21-cellen. Na vier tot zes uur incubatie worden de cellen bedekt met 0,5% agarose in MEM plus FBS en gedurende nog vier dagen gekweekt.BHK21-cellen werden mock-electroporeerd of electroporeerd met RNA-transcripten afgeleid van twee onafhankelijke klonen van de volledige JEV-BAC. Vier dagen later werden de cellen gekleurd met kristalviolet om het infectieuze RNA in de cellen te visualiseren. Met behulp van deze kleuring werden de infectieuze centra gekwantificeerd. Vervolgens werd de expressie van virale eiwitten in de met RNA electroporeerde cellen 20 uur na transfectie onderzocht met behulp van anti-NS-one konijnen antiserum en een Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam, zichtbaar in rood. De kernen werden tegengekleurd met DAPI, zichtbaar in blauw. Later, op 22 en 40 uur na transfectie, werd de productie van infectieuze virionen die zich ophoopten in de cultuursupernatanten van de met RNA electroporeerde cellen onderzocht via plaque-assays.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u infectieus virus volledig kunt redden uit een gekloonde cDNA van een positieve stam, RNA, zoals het Japanse encefalitisvirus. Vergeet niet dat het werken met het Japanse encefalitisvirus en andere humane pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn. Een juiste biosafety-training is noodzakelijk voordat u deze procedure uitvoert.

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Bron: Yun, S. et al. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (2015)Deze video demonstreert het herstel van het infectieuze Japanse encefalitisvirus uit synthetisch RNA, getranscribeerd vanuit een bacterieel artificieel chromosoomklon. Er wordt getoond hoe cellen worden geëlectroporeerd met het synthetische RNA, waardoor het virale genoom de productie van nieuwe virionen kan sturen. De resulterende plaques die...

Herstel van infectieuze virionen uit cellen getransfecteerd met synthetisch RNA afgeleid van een bacterieel kunstmatig chromosoom

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

De recente epidemie van het Zikavirus wijst op het belang van het opzetten van omgekeerde genetische benaderingen om vaccins en/of therapeutische strategieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we het protocol om een infectieus recombinant Zikavirus te redden van een volledige cDNA-kloon, geassembleerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom onder controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor.

Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Hier presenteren we een protocol om de pVAX1-PRRSV-expressievector te verkrijgen door geschikte beperkingsplaatsen te introduceren aan het 3'-uiteinde van de inserts. We kunnen de vector lineariseren en DNA-fragmenten één voor één aan de vector verbinden door middel van homologe recombinatietechnologie.

Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus

Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.

Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie

Leer hoe je infectieuze virusdeeltjes redt uit gekloonde cDNA van positief-streng RNA-virussen zoals Japans encefalitisvirus. Deze methode maakt genetische manipulatie en vaccinontwikkeling mogelijk.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Meer video's verkennen