Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Het algemene doel van deze procedure is om infectieuze virusdeeltjes te redden die volledig zijn gemaakt van een gekloonde CDNA van positieve streng, RNA-virussen waarvan de genomen dezelfde polariteit hebben als cellulair Mr.NA, zoals het Japanse encefalitisvirus. Deze CDNA-gebaseerde regene-genetica is een semiale methode die directe manipulatie van het virale genomische RNA mogelijk maakt, waardoor recombinante virussen worden gegenereerd voor moleculair en genetisch onderzoek naar virale replicatie en pathogenese. Deze techniek biedt ook een waardevolle platform die de ontwikkeling van genetisch gedefinieerde vaccins en virale vectoren voor de levering van vreemde genen mogelijk maakt.

Deze vaten zijn toepasbaar voor het klonen van volledige CDNA voor lengte of positieve stam, RNA-virussen, met name die met genomen groter dan 10 kb. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door verschillende leden van mijn laboratoriumonderzoeksassistent Professor San Nun to postdoctoral fellow UNG en Xing y Kim en de undergraduate studenten, Jordan Frank. Het videogedeelte van deze publicatie behandelt de voorbereiding van de bacteriële kunstmatige chromosoom met de sequenties van belang, de synthese van RNA, getranscribeerd vanaf de achter-plasmide, en hoe de infectiviteit van de RNA's en de virusopbrengst te meten.

Alle procedures die worden gebruikt voorafgaand aan het genereren van de achter-plasmide worden in het tekstprotocol in grote detail gegeven. Voor deze procedure, kweek eerst een enkele kolonie van e coli DH 10 B, dragende de achter-plasmide in drie milliliters van twee XYT-broth met chlooramfenicol. Incubeer de cultuur gedurende 10 uur bij 35 graden Celsius met schudden bij 225 tot 250 RPM.

Na 10 uur, schaal de cultuur op, inoculeer vervolgens 500 microliters van groei in 500 milliliters medium en cultiveer het inoculum gedurende zes uur met krachtig schudden na zes uur. Centrifugeer de bacteriële cultuur in 2 250 milliliter flessen bij 3.100 Gs gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer vervolgens elk pellet in 30 milliliters GTE-oplossing.

Voeg 500 microliters lysozym toe en incubeer de suspensies op ijs gedurende 10 minuten. Bereid ondertussen verse lysisoplossing voor voor de volgende stap. Voeg na 10 minuten 60 milliliters van de lysisoplossing toe en meng door te zwaaien totdat de oplossing helder lijkt.

Laat de reacties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten gaan. Voeg vervolgens 45 milliliters neutralisatieoplossing toe aan elke fles en draai de flessen om tot ze goed gemengd zijn. Leg ze dan 10 minuten op ijs.

Verzamel de geneutraliseerde lysaten met de hoge G gekoelde centrifugatie. Verzamel vervolgens de supernatanten in twee nieuwe 250 milliliter flessen. Voeg 0,6 volumes van 100% isopropanol toe aan elk en leg ze 20 minuten op ijs.

Spin vervolgens de precipitaatjes naar beneden, gooi de supernatanten weg en lost de pellets op in vijf milliliters TE-buffer. Combineer de twee volumes in een enkele 50 milliliter buis en precipitateer het RNA door een gelijk volume van vijf mola lithiumchloride toe te voegen en de mixtuur op ijs gedurende 10 minuten te incuberen. Gebruik een 20 minuten koude centrifugatie om het RNA-precipitaat te verzamelen.

Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe 250 milliliter buis. Voeg twee volumes van 100% isopropanol toe en zet de buis op ijs zodat het DNA-precipitaat zich zal vormen. Na 20 minuten, spin het precipitaat naar beneden, aspireer het supernatant, resuspendeer het DNA-pellet in 9,5 milliliters TE-buffer en breng de DNA-oplossing over naar een 50 milliliter buis.

Vervolg de voorbereiding door de cesiumchloridegradiënt op te zetten met een th diumbromide. Laad de mixtuur in een afsluitbare polypropyleen buis met een spuit met een 18 gauge naald en sluit de buis af. Draai de afgesloten buis een nacht in een ultracentrifuge om een cesiumchloridegradiënt te vormen.

Verzamel de volgende dag een DNA-band van achter-plasmide uit de cesiumchloridegradiënt. Gebruik een 18 gauge naald om een luchtventilatie aan de bovenkant van de gradiënt te creëren en een 20 gauge naald met spuit om het achter-DNA van de zijkant van de gradiënt te verzamelen, en breng vervolgens de verzameling over naar een 1,7 milliliter micro fuge buis. Voer een wassing uit, voeg 2,5 volumes van waterverzadigd butanol toe en meng met normale vortexing.

Centrifugeer vervolgens de mixtuur bij kamertemperatuur en breng de onderste waterfase over naar een nieuwe 1,7 milliliter micro fuge buis. Herhaal deze wassing in totaal zes keer om alle ethidiumbromide te verwijderen. Precipiteer nu het achter-DNA.

Voeg een een tiende volume van drie molar natriumacetaat en 2,5 volumes van 100% ethanol toe aan de buis. Incubeer de mixtuur op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens het precipitaat bij kamertemperatuur en was het DNA-pellet met een milliliter van 70% ethanol.

Herhaal de spin en verzamel het pellet opnieuw. Droog tenslotte het gepelletiseerde DNA gedurende 10 minuten en uteer het in 200 microliters TE-buffer. Begin met een grootschalige restrictie-enzymdigestie van de achter-plasmide met xbo.

Een in een totaal volume van 100 microliters. Voer deze digestie uit bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 15 uur. Incubeer vervolgens de digestie met een extra 25 eenheden van boonenmung nuclease bij 30 graden Celsius gedurende twee uur.

Na de incubatie, breng het volume op tot 300 microliters met gedistilleerd water. Voer nu een fenolextractie uit door een gelijk volume fenol chloroform, isoamylalcohol toe te voegen aan het verdunde monster. Vortex gedurende een minuut krachtig, draai de buis naar beneden en breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe buis.

Herhaal vervolgens de extractie met chloroform. Herstel vervolgens het gelineaireerde achter-DNA door ethanolprecipitatie. Verzamel het DNA-pellet met centrifugatie, gooi het supernatant weg en was het pellet met een milliliter van 70% ethanol.

Herhaal de centrifugaties