Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering
22 mei 2021
De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.
Translationele regulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen. Polysomale profilering biedt een nuttig en krachtig hulpmiddel om de translationele status van mRNA te beoordelen, waardoor het mogelijk is om translationele controlefuncties tijdens de hersenontwikkeling te onderzoeken. Deze methode is een eenvoudige en goedkope aanpak om sucrosegradiënten te maken en polysoomfractie te beoordelen.
In dit protocol wordt het gebruikt om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast om andere systemen te bestuderen. Begin met het verdunnen van 2,2 molaire sucrose om zes 10 tot 50% sacharosegradiënten voor te bereiden.
Vul een spuit van 30 milliliter met ongeveer 16 milliliter 10% sacharose, plaats deze op de spuitpomp en sluit deze aan op de naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit, slang of naald zitten en veeg de punt van de naald af om eventuele restoplossing te verwijderen. Beweeg het gemotoriseerde stadium zodanig omhoog dat de punt van de naald het midden van de buis aan de onderkant raakt.
Stel de spuitpomp in op een debiet van twee milliliter per minuut voor een volume van 2,3 milliliter. Na het doseren van 2,3 milliliter 10% sacharoseoplossing, gaat u door het gemotoriseerde stadium en herhaalt u het proces voor alle zes gradiënten. Voeg vervolgens 20% sacharose-oplossing toe aan de bodem van de buizen, gevolgd door 30, 40 en 50%Verzamel CD1-muisembryo's op embryonale dag 12 en plaats ze in een plaat van 10 centimeter met ijskoude HBSS op ijs.
Breng onder de dissectie scope één embryo over op een plaat van zes centimeter met ijskoude HBSS. Gebruik naalden van 21 tot 23 gauge om de positie van het hoofd te bevestigen door onder een hoek van 45 graden door de ogen te penetreren en een kracht uit te brengen om ervoor te zorgen dat de naalden op de plaat zijn bevestigd. Gebruik nummer vijf tangen om de huid en schedel te verwijderen die van het midden naar de zijkanten werken, snijd vervolgens de olfactorische bollen en verwijder de hersenvliezen om de corticale weefsels bloot te leggen.
Gebruik gebogen tang om de corticale weefsels in twee tot drie milliliter neurobasaal medium op ijs te snijden. Trek de weefsels uit verschillende embryo's als dat nodig is. Weefsels van acht tot 10 embryo's geven meestal ongeveer 200 microgram totaal RNA.
Voeg cycloheximide toe aan het neurobasale medium met de ontlede weefsels tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer het weefsel gedurende vijf minuten op 500 x g bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Was de weefsels tweemaal met ijskoud PBS aangevuld met 100 microgram per milliliter cycloheximide.
Voeg 500 microliters cellysisbuffer toe, aangevuld met vier microliters RNase-remmer en pipet op en neer om het weefsel te resuspenden. Gebruik een insulinenaald om het weefsel voorzichtig te lyseren. Incubeer vervolgens 10 minuten op ijs met korte vortexing om de twee tot drie minuten.
Centrifugeer na de incubatie het lysaat bij 2000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs. Herhaal dit proces nogmaals met centrifugeren op 13,000 x g. Na het overbrengen van het supernatant naar een nieuwe centrifugebuis op ijs, meet u de RNA-concentratie in het weefsellysaat met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.
Plaats de monsters bovenop de sacharosegradiënten door het lysaat langzaam aan de wanden van de ultracentrifugebuizen te doseren. Plaats de sacharosegradiënten voorzichtig in de emmers en ultracentrifugeer de monsters gedurende 90 minuten op 190, 000 x g en vier graden Celsius. Plaats een lege ultracentrifugebuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem.
Vul een spuit van 30 milliliter met 25 milliliter 60% sucrose chase oplossing. Druk vervolgens voorzichtig op de spuit zodat de chase-oplossing de lege buis vult en door de 254 nanometer UV-monitor gaat om de basislijn voor detectie in te stellen. Druk op auto zero op de UV-monitor om een basislijn voor detectie te registreren en druk vervolgens op Afspelen op de software om te beginnen met opnemen.
Zodra het systeem een basislijn heeft vastgesteld, pauzeert u de opname van de software en trekt u de chase-oplossing in, zodat er geen restachtervolgingsoplossing in het systeem achter blijft. Plaats één monsterbuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem. Begin met opnemen op de software, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de lijn zitten.
Start vervolgens de spuitpomp en de fractiecollector om polysomale fracties te verzamelen en stel de fractionator in op 30 seconden. Verzamel de fracties in buizen van 1,5 milliliter. Het corticale lysaat dat RNA bevat dat uit acht embryo's wordt getrokken, werd gescheiden door een sacharosegradiënt in 12 fracties.
Pieken van UV-absorptie bij 254 nanometer geïdentificeerde fracties die de 40S subunit 60S subunit en 80S monosomen en polysomen bevatten. Analyse van de fracties door westerse vlek voor de grote ribosomale subeenheid Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid monosomen en polysomen. Cytoplasmatische eiwitten, Gapdh en Csde1 daarentegen, werden niet geassocieerd met ribosomen, maar werden verrijkt in fracties die vrij RNA bevatten.
In overeenstemming met de scheiding van eiwitten in verschillende fracties, werden Gapdh en sox2 mRNAs sterk verrijkt in de fracties die zware polysomen bevatten, wat suggereert dat deze mRNAs efficiënt worden vertaald in de zich ontwikkelende cortex. Daarentegen werden rpl7 en rpl35 mRNAs verrijkt in de fractie die monosomen bevatte, wat een onderdrukte vertaling suggereert. Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om consistentie te behouden bij het maken van sacharosegradiënten.
De spuitpompen moeten worden gebruikt om de sacharose uit te werpen. Tijdens fractionering en monsterverzameling is het belangrijk om het systeem te wassen met RNase-vrij water. Dit vermindert eventuele resterende sacharose die overblijft van het vorige monster.
Deze methode kan worden gebruikt om de translationele status van mRNAs in verschillende weefsels te beoordelen. Met behulp van het platform kunnen consistente gradiënten voor polysomale profilering worden verkregen, wat een goedkope oplossing biedt voor deze klassieke en nuttige techniek.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een polysoom-profileringssysteem gericht op het beoordelen van de translationele status van mRNA's in de zich ontwikkelende hersenen van zoogdieren. De methode maakt gebruik van een gemakkelijk te assembleren sucrose-gradiënt- en fractieplatform om de translationele controlefuncties in de zich ontwikkelende muizencortex te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genexpressie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Translationele regulatie is cruciaal voor hersenontwikkeling.
- Polysoomprofilering is een effectieve techniek om mRNA-translatie te onderzoeken.
- De methode maakt goedkope experimenten mogelijk en kan worden aangepast aan verschillende systemen.
Doel van de studie
- Om een platform te ontwikkelen voor het beoordelen van de translationele status van mRNA's.
- Om de rol van translationele controle in de zich ontwikkelende hersenen te onderzoeken.
- Om een toegankelijk protocol te bieden voor onderzoekers op dit gebied.
Gebruikte methoden
- De studie gebruikt een sucrose-gradiënt- en fractieplatform.
- Het biologische model omvat de zich ontwikkelende muizencortex, specifiek het analyseren van corticale weefsels.
- Belangrijke tijdlijnen omvatten de bereiding van verschillende sucrose-gradiënten en daaropvolgende centrifugatie-stappen.
- Aanvullende belangrijke stappen omvatten weefseldissocatie, RNA-meting en UV-monitoring.
Belangrijkste resultaten
- De methode scheidt met succes mRNA's op basis van translationele status, waarbij verschillende ribosomaal subeenheden en polysomen worden geïdentificeerd.
- Specifieke mRNA's werden geassocieerd met zware polysomen, wat aangeeft dat er actieve translatie plaatsvindt, terwijl andere verrijkt waren in monosoomfracties, wat suggereert dat er onderdrukte translatie is.
- Western blot-analyse bevestigde de aanwezigheid van specifieke ribosomaal eiwitten in de geïdentificeerde fracties.
Conclusies
- Deze studie maakt een reproduceerbare benadering mogelijk voor het onderzoeken van mRNA-translatie tijdens hersenontwikkeling.
- De aanpasbaarheid van de methode maakt beoordeling in verschillende weefsels mogelijk, wat bijdraagt aan ons begrip van neuronale mechanismen.
- Inzichten in translationele controle kunnen toekomstig onderzoek naar neuronale plasticiteit en ontwikkeling informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Translational regulation is a critical inflection point in neurodevelopmental target validation and mechanistic de-risking for CNS drug discovery. Polysome profiling enables direct measurement of mRNA translation efficiency, providing predictive confidence in gene expression control during neural differentiation. This capability supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying translational bottlenecks in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of translational control mechanisms underlying neural stem cell fate decisions.
- Supports functional target validation by distinguishing actively translated mRNAs from repressed transcripts.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping translational outputs to specific gene targets.
- Improves predictive confidence in pathway modulation strategies for neurodevelopmental disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neural tissue systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of mRNA translation status across gene targets.
- Enables assay standardization and platform reuse for translational efficiency measurements.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules impacting translational regulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns translational biomarker discovery with disease-relevant neural models.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation of translational control points.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying translational bottlenecks.
- Provides mechanistic insight into gene expression regulation in developing brain tissue.
Pipeline & Workflow Integration
Polysome profiling integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling direct assessment of translational regulation in neural tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying translation of specific mRNAs.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers UV absorbance and Western blot readouts to compare translational status across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neural systems for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for translational studies across diverse tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable translational profiling workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection and RNA handling.
- Needs access to ultracentrifugation and UV absorbance instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of gradient preparation and sample processing.
- Adaptable to various tissue types and developmental stages with protocol optimization.
- Reproducibility depends on consistent gradient formation and RNase-free conditions.
