Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Translationele regulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen. Polysomale profilering biedt een nuttig en krachtig hulpmiddel om de translationele status van mRNA te beoordelen, waardoor het mogelijk is om translationele controlefuncties tijdens de hersenontwikkeling te onderzoeken. Deze methode is een eenvoudige en goedkope aanpak om sucrosegradiënten te maken en polysoomfractie te beoordelen.

In dit protocol wordt het gebruikt om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast om andere systemen te bestuderen. Begin met het verdunnen van 2,2 molaire sucrose om zes 10 tot 50% sacharosegradiënten voor te bereiden.

Vul een spuit van 30 milliliter met ongeveer 16 milliliter 10% sacharose, plaats deze op de spuitpomp en sluit deze aan op de naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit, slang of naald zitten en veeg de punt van de naald af om eventuele restoplossing te verwijderen. Beweeg het gemotoriseerde stadium zodanig omhoog dat de punt van de naald het midden van de buis aan de onderkant raakt.

Stel de spuitpomp in op een debiet van twee milliliter per minuut voor een volume van 2,3 milliliter. Na het doseren van 2,3 milliliter 10% sacharoseoplossing, gaat u door het gemotoriseerde stadium en herhaalt u het proces voor alle zes gradiënten. Voeg vervolgens 20% sacharose-oplossing toe aan de bodem van de buizen, gevolgd door 30, 40 en 50%Verzamel CD1-muisembryo's op embryonale dag 12 en plaats ze in een plaat van 10 centimeter met ijskoude HBSS op ijs.

Breng onder de dissectie scope één embryo over op een plaat van zes centimeter met ijskoude HBSS. Gebruik naalden van 21 tot 23 gauge om de positie van het hoofd te bevestigen door onder een hoek van 45 graden door de ogen te penetreren en een kracht uit te brengen om ervoor te zorgen dat de naalden op de plaat zijn bevestigd. Gebruik nummer vijf tangen om de huid en schedel te verwijderen die van het midden naar de zijkanten werken, snijd vervolgens de olfactorische bollen en verwijder de hersenvliezen om de corticale weefsels bloot te leggen.

Gebruik gebogen tang om de corticale weefsels in twee tot drie milliliter neurobasaal medium op ijs te snijden. Trek de weefsels uit verschillende embryo's als dat nodig is. Weefsels van acht tot 10 embryo's geven meestal ongeveer 200 microgram totaal RNA.

Voeg cycloheximide toe aan het neurobasale medium met de ontlede weefsels tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer het weefsel gedurende vijf minuten op 500 x g bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Was de weefsels tweemaal met ijskoud PBS aangevuld met 100 microgram per milliliter cycloheximide.

Voeg 500 microliters cellysisbuffer toe, aangevuld met vier microliters RNase-remmer en pipet op en neer om het weefsel te resuspenden. Gebruik een insulinenaald om het weefsel voorzichtig te lyseren. Incubeer vervolgens 10 minuten op ijs met korte vortexing om de twee tot drie minuten.

Centrifugeer na de incubatie het lysaat bij 2000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs. Herhaal dit proces nogmaals met centrifugeren op 13,000 x g. Na het overbrengen van het supernatant naar een nieuwe centrifugebuis op ijs, meet u de RNA-concentratie in het weefsellysaat met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.

Plaats de monsters bovenop de sacharosegradiënten door het lysaat langzaam aan de wanden van de ultracentrifugebuizen te doseren. Plaats de sacharosegradiënten voorzichtig in de emmers en ultracentrifugeer de monsters gedurende 90 minuten op 190, 000 x g en vier graden Celsius. Plaats een lege ultracentrifugebuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem.

Vul een spuit van 30 milliliter met 25 milliliter 60% sucrose chase oplossing. Druk vervolgens voorzichtig op de spuit zodat de chase-oplossing de lege buis vult en door de 254 nanometer UV-monitor gaat om de basislijn voor detectie in te stellen. Druk op auto zero op de UV-monitor om een basislijn voor detectie te registreren en druk vervolgens op Afspelen op de software om te beginnen met opnemen.

Zodra het systeem een basislijn heeft vastgesteld, pauzeert u de opname van de software en trekt u de chase-oplossing in, zodat er geen restachtervolgingsoplossing in het systeem achter blijft. Plaats één monsterbuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem. Begin met opnemen op de software, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de lijn zitten.

Start vervolgens de spuitpomp en de fractiecollector om polysomale fracties te verzamelen en stel de fractionator in op 30 seconden. Verzamel de fracties in buizen van 1,5 milliliter. Het corticale lysaat dat RNA bevat dat uit acht embryo's wordt getrokken, werd gescheiden door een sacharosegradiënt in 12 fracties.

Pieken van UV-absorptie bij 254 nanometer geïdentificeerde fracties die de 40S subunit 60S subunit en 80S monosomen en polysomen bevatten. Analyse van de fracties door westerse vlek voor de grote ribosomale subeenheid Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid monosomen en polysomen. Cytoplasmatische eiwitten, Gapdh en Csde1 daarentegen, werden niet geassocieerd met ribosomen, maar werden verrijkt in fracties die vrij RNA bevatten.

In overeenstemming met de scheiding van eiwitten in verschillende fracties, werden Gapdh en sox2 mRNAs sterk verrijkt in de fracties die zware polysomen bevatten, wat suggereert dat deze mRNAs efficiënt worden vertaald in de zich ontwikkelende cortex. Daarentegen werden rpl7 en rpl35 mRNAs verrijkt in de fractie die monosomen bevatte, wat een onderdrukte vertaling suggereert. Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om consistentie te behouden bij het maken van sacharosegradiënten.

De spuitpompen moeten worden gebruikt om de sacharose uit te werpen. Tijdens fractionering en monsterverzameling is het belangrijk om het systeem te wassen met RNase-vrij water. Dit vermindert eventuele resterende sacharose die overblijft van het vorige monster.

Deze methode kan worden gebruikt om de translationele status van mRNAs in verschillende weefsels te beoordelen. Met behulp van het platform kunnen consistente gradiënten voor polysomale profilering worden verkregen, wat een goedkope oplossing biedt voor deze klassieke en nuttige techniek.