Name: Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Leer hoe eilandjesfunctie en immuuncelinteracties worden bestudeerd in levende pancreasweefselplakken. Deze methode behoudt het native micro-milieu voor onderzoek naar diabetes en pancreatitis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 en P01 AI042288. Dit onderzoek is uitgevoerd met steun van het Netwerk voor Pancreas orgaandonoren met Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), een gezamenlijk type 1 diabetes onderzoeksproject gesponsord door JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), en The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). De inhoud en meningen die worden geuit, zijn de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) die samenwerken met nPOD om onderzoeksbronnen te bieden, worden vermeld op http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Dank aan Dr. Kevin Otto, Universiteit van Florida, voor het leveren van de vibratie die wordt gebruikt om muisplakken te genereren.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Het doel van dit protocol is om het genereren van pancreasplakken en de procedures die nodig zijn om de plakjes te gebruiken in functionele en immunologische studies te verklaren. Er zijn veel voordelen aan het gebruik van levende pancreasplakken. Er zijn echter verschillende kritieke stappen die essentieel zijn voor het weefsel om levensvatbaar en nuttig te blijven tijdens de beschreven experimentprotocollen. Het is noodzakelijk om snel te werken. De tijdsduur tussen het injecteren van de alvleesklier en het genereren v...

Betrokkenheid van de alvleesklier is pathognomonisch voor ziekten zoals pancreatitis, T1D en T2D1,2,3. De studie van de functie in geïsoleerde eilandjes omvat meestal het verwijderen van de eilandjes uit hun omgeving4. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel is ontwikkeld om de studie van pancreasweefsel mogelijk te maken met behoud van intacte micro-omgevingen van eilandjes en het vermijden van het gebruik van stressvolle isolatieprocedures voor eilandjes5,6,7. Pancreasweefselplakken van menselijk donorweefsel zijn met succes gebruikt om T1D te bestuderen en hebben processen van bètacelverlies en disfunctie aangetoond naast immuuncelinfiltratie8,9,10,11,12,13. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel kan worden toegepast op zowel muis- als menselijk pancreasweefsel5,6,8. Menselijke pancreasweefselplakken uit orgaandonorweefsels worden verkregen door een samenwerking met het Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD). Muissegmenten kunnen worden gegenereerd uit verschillende muizenstammen.
Dit protocol zal zich richten op niet-obese diabetische recombinatie activerende gen-1-null (NOD. Rag1-/-) en T-celreceptor transgeen (AI4) (NOD. Vod1-/-. AI4 α/β) muisstammen. KNIKKEN. Rag1-/- muizen zijn niet in staat om T- en B-cellen te ontwikkelen als gevolg van een verstoring in het recombinatie-activerende gen 1 (Rag1)14. KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β muizen worden gebruikt als model voor versnelde diabetes type 1 omdat ze een enkele T-celkloon produceren die zich richt op een epitoop van insuline, wat resulteert in consistente eilandjesinfiltratie en snelle ziekteontwikkeling15. Het protocol dat hier wordt getoond, beschrijft procedures voor functionele en immunologische studies met behulp van levende menselijke en muis pancreasplakken door de toepassing van confocale microscopiebenaderingen. De hierin beschreven technieken omvatten levensvatbaarheidsbeoordelingen, eilandjesidentificatie en -locatie, cytosolische Ca2 + -opnames, evenals kleuring en identificatie van immuuncelpopulaties.

<table><tbody><tr><td>#3 Style Scalpel Handle</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Buffer, 1M Solution</td></tr><tr><td>10 cm Untreated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Syringe</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td></tr><tr><td>27 G Needle</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td></tr><tr><td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Dish 35 mm, high</td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8-well chambered coverglass</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a antibody</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (dihydrate)</td></tr><tr><td>Compact Digital Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser-scanning microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Pinhole&thinsp;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&thinsp;&times;&thinsp;512 pixel resolution</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimethyl sulfoxide</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Surgical Blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>cell-permeable Ca2+ indicator</td></tr><tr><td>Gel Control Super Glue</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Hardened Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&trade; Kimwipes&trade; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td></tr><tr><td>Low glucose DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahydrate)</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahydrate)</td></tr><tr><td>Magnetic Heated Platform</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Syringe Filter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Paintbrush</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>cell-permeable Ca2+ indicator</td></tr><tr><td>Overnight imaging chamber</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>To make agarose for slice generation</td></tr><tr><td>PE-labeled insulin tetramer</td><td>Emory Tetramer Research Core</td><td>sequence YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71998</td><td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque low melting-point agarose</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>To make agarose for slice generation</td></tr><tr><td>Slice anchor</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Slice anchor (dynamic imaging)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (monohydrate)</td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td></tr><tr><td>Stage Adapter</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td></tr><tr><td>Stage-top incubator</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&trade; Plastic Disposable Transfer Pipets</td></tr><tr><td>Valve Control System</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>System for dynamic stimulation recordings</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>

observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Levende pancreasweefselplakken maken de studie van eilandjesfysiologie en -functie mogelijk in de context van een intacte micro-omgeving van eilandjes. Plakjes worden bereid uit levend menselijk en muis pancreasweefsel ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome. Deze methode zorgt ervoor dat het weefsel levensvatbaarheid en functie behoudt, naast het behoud van onderliggende pathologieën zoals type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D). De slice-methode maakt nieuwe richtingen mogelijk in de studie van de pancreas door het onderhoud van de complexe structuren en verschillende intercellulaire interacties die de endocriene en exocriene weefsels van de pancreas omvatten. Dit protocol demonstreert hoe kleuring en time-lapse microscopie van levende endogene immuuncellen in pancreasplakken kunnen worden uitgevoerd, samen met beoordelingen van de eilandjesfysiologie. Verder kan deze benadering worden verfijnd om immuuncelpopulaties te onderscheiden die specifiek zijn voor eilandcelantigenen met behulp van belangrijke histocompatibiliteit complex-multimeerreagentia.

Dit protocol levert levende pancreasweefselplakken op die geschikt zijn voor zowel functionaliteitsstudies als immuuncelopnamen. Het uiterlijk van de segmenten in zowel helder als ondergereflecteerd licht is weergegeven in figuur 1A,B. Zoals besproken, kunnen eilandjes worden gevonden in plakjes met gereflecteerd licht vanwege hun verhoogde granulariteit die optreedt vanwege hun insulinegehalte (figuur 1C) en worden ze duidelijk waargenomen in v...

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Ons protocol zal helpen bij het beantwoorden van de impact die immuuncelinteracties hebben op de eilandjesfunctionaliteit. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel maakt het mogelijk om de fysiologie en functie van eilandjes te bestuderen met behoud van de weefsels die ten grondslag liggen aan pathologieën en de inheemse micro-omgeving. Deze methode zou inzicht kunnen geven in de ziekteprocessen van pancreasziekten, zoals pancreatitis, diabetes type I en diabetes type II.Plaats om te beginnen de blokken op de monsterhouder zodanig dat ze de bladbreedte niet overschrijden, zodat het blad zo min mogelijk naar voren kan bewegen wanneer de trilling langzaam beweegt. Breng een lijn superlijm aan op de monsterhouder, maak een dunne laag met behulp van het uiteinde van de lijmdispenser en draai vervolgens de tissueblokken op de lijm zodat de kant dicht bij het weefsel naar boven is gericht. Duw de blokken voorzichtig naar beneden en laat de lijm drie minuten drogen.Bevestig vervolgens de plaat met een schroef aan de trilpan en pas de hoogte en afstand van het blad aan, zodat het blad over de lengte van blokken beweegt en er nauwelijks boven komt. Duw de blokken voorzichtig met de tang om te controleren of de lijm is opgedroogd en vul vervolgens de vibratome-lade met een gekoelde extracellulaire oplossing totdat het mes is bedekt. Stel de trilling in om plakjes van 120 micrometer dikte te maken en start het, observeer vervolgens de plakjes die van de weefselblokken komen.Til de plakjes op wanneer ze van het blok drijven door er een verfkwast of tang onder te plaatsen en plaats de plakjes in Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer met drie millimolar D-glucose en trypsineremmer. Leg de platen met de plakjes op een wip en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur bij 25 RPM. Als de plakjes langer bewaard moeten worden, plaats de plakjes dan in 15 milliliter plakcultuurmedium en plaats het bord in een couveuse.Incubeer de bereide plakjes bij 37 graden Celsius voor studies op dezelfde dag of breng de plakjes die 's nachts bij 24 graden Celsius zijn gekweekt over naar 37 graden Celsius gedurende ten minste één uur vóór het experiment. Schakel de microscoop ten minste een uur voor de opname in en breng de incubator van de podiumtop in evenwicht tot 37 graden Celsius. Bevestig de petrischaal met de glazen bodem met het plakje op het podium.Richt de microscoop door het 10X-objectief in de brightfield-modus in te stellen en lokaliseer de eilandjes met behulp van de bright field-modus door te zoeken naar oranjebruin gekleurde ovalen in de slice. Schakel de microscoop over naar confocale beeldvorming door op de CS-knop op de touchscreencontroller van de microscoop te drukken. Als u de eilandjes wilt bekijken met behulp van reflectie, schakelt u de 638-laserdetector en PMT-detector in.Stel het laservermogen in tussen één en 2% en schakel de inkepingsfilters uit. Gebruik de 405 nanometer laser en PMT detector om de nucleïnezuurvlek te observeren. De hybride detector voor de CD8 antilichaamdetectie en de 488 nanometer laser en hybride detector om het insulinetetrameer te bekijken.Centreer het interessante eilandje in het gezichtsveld met behulp van de X- en Y-knoppen van de podiumcontroller. Zodra een interessant eilandje zich bevindt, schakelt u over naar het 20X-objectief en zoomt u in, zodat het eilandje het grootste deel van het frame in beslag neemt. Neem een z-stack van het eilandje en zoek vervolgens de beste optische secties waar de cellen leven en eventuele omliggende immuuncellen in focus zijn.Stel de microscoop in om op te nemen in XYZT-modus en optimaliseer de instellingen om elke 20 minuten een z-stack van de geselecteerde stappen op te nemen gedurende een periode van enkele uren. De eilandjes in een plak pancreasweefsel werden gevisualiseerd met behulp van brightfield en gereflecteerde lichtmicroscopie. De insuline in de eilandjes verhoogt de granulariteit en veroorzaakt absorptie van grote hoeveelheden gereflecteerd licht, waardoor de zichtbaarheid van de eilandjes toeneemt.De levensvatbaarheid van een levend menselijk pancreasweefsel werd beoordeeld door middel van kleuring. De levende cellen zijn aangegeven in groen en de dode cellen in blauw. Een andere positieve indicator voor levensvatbaarheid is waarneembare basale activiteit.Wanneer een levende pancreasschijf werd geladen met een celdoorlatende calciumindicator, werd glucosestimulatie waargenomen in zowel muis- als menselijke pancreasplakken. De fluorescentie van individuele cellen tijdens glucosestimulatie werd ook gekwantificeerd. Intacte en zieke eilandjes werden waargenomen met behulp van dithizone-kleuring en gereflecteerde lichtmicroscopie.De zieke eilandjes beginnen granulariteit te verliezen als gevolg van immuuncelinfiltratie en celdood. Immuuncelpopulaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van CD8-antilichamen en insulinetetrameerkleuring. Co-kleuring geeft aan dat de cellen effector T-cellen zijn die specifiek gericht zijn op het insulineantigeen.Het meest kritieke om te onthouden in deze procedure is om de plakjes in oplossingen proteaseremmer te allen tijde te houden. Na deze procedure kunnen tal van functionaliteiten in immuuncelexperimenten worden uitgevoerd, waardoor het effect van immuuncelinteracties en eilandjesfunctie kan worden bestudeerd.

observing-islet-function-islet-immune-cell-interactions-live

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Nieuwe computer-ondersteunde methoden van grootschalige inkoop en de analyse van immunohistochemisch gekleurde alvleesklier exemplaren zijn beschreven: (1) Virtual Snijd verovering van de hele afdeling, (2) massa-analyse van grootschalige data, (3) Reconstructie van 2D Virtual Slices , (4) 3D eilandje in kaart brengen, en (5) Wiskundige analyse.

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

We presenteren de bereiding van acute pancreasweefselplakken en hun gebruik in confocale laserscanmicroscopie om calciumdynamica gelijktijdig te bestuderen in een groot aantal levende cellen, gedurende lange tijdsperioden en met een hoge spatiotemporale resolutie.

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Dit protocol beschrijft hoe menselijke alvleesklierplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd om de celfunctie onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze innovatieve aanpak maakt het mogelijk om normale en structureel beschadigde eilandjes te onderzoeken en de ingewikkelde wisselwerking tussen endocriene en exocriene compartimenten.

Het genereren van plakjes menselijk pancreasweefsel om endocriene en exocriene pancreasfysiologie te bestuderen

Leer hoe eilandjesfunctie en immuuncelinteracties worden bestudeerd in levende pancreasweefselplakken. Deze methode behoudt het native micro-milieu voor onderzoek naar diabetes en pancreatitis.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Meer video's verkennen