Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken
12 april 2021
Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.
Ons protocol zal helpen bij het beantwoorden van de impact die immuuncelinteracties hebben op de eilandjesfunctionaliteit. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel maakt het mogelijk om de fysiologie en functie van eilandjes te bestuderen met behoud van de weefsels die ten grondslag liggen aan pathologieën en de inheemse micro-omgeving. Deze methode zou inzicht kunnen geven in de ziekteprocessen van pancreasziekten, zoals pancreatitis, diabetes type I en diabetes type II.
Plaats om te beginnen de blokken op de monsterhouder zodanig dat ze de bladbreedte niet overschrijden, zodat het blad zo min mogelijk naar voren kan bewegen wanneer de trilling langzaam beweegt. Breng een lijn superlijm aan op de monsterhouder, maak een dunne laag met behulp van het uiteinde van de lijmdispenser en draai vervolgens de tissueblokken op de lijm zodat de kant dicht bij het weefsel naar boven is gericht. Duw de blokken voorzichtig naar beneden en laat de lijm drie minuten drogen.
Bevestig vervolgens de plaat met een schroef aan de trilpan en pas de hoogte en afstand van het blad aan, zodat het blad over de lengte van blokken beweegt en er nauwelijks boven komt. Duw de blokken voorzichtig met de tang om te controleren of de lijm is opgedroogd en vul vervolgens de vibratome-lade met een gekoelde extracellulaire oplossing totdat het mes is bedekt. Stel de trilling in om plakjes van 120 micrometer dikte te maken en start het, observeer vervolgens de plakjes die van de weefselblokken komen.
Til de plakjes op wanneer ze van het blok drijven door er een verfkwast of tang onder te plaatsen en plaats de plakjes in Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer met drie millimolar D-glucose en trypsineremmer. Leg de platen met de plakjes op een wip en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur bij 25 RPM. Als de plakjes langer bewaard moeten worden, plaats de plakjes dan in 15 milliliter plakcultuurmedium en plaats het bord in een couveuse.
Incubeer de bereide plakjes bij 37 graden Celsius voor studies op dezelfde dag of breng de plakjes die 's nachts bij 24 graden Celsius zijn gekweekt over naar 37 graden Celsius gedurende ten minste één uur vóór het experiment. Schakel de microscoop ten minste een uur voor de opname in en breng de incubator van de podiumtop in evenwicht tot 37 graden Celsius. Bevestig de petrischaal met de glazen bodem met het plakje op het podium.
Richt de microscoop door het 10X-objectief in de brightfield-modus in te stellen en lokaliseer de eilandjes met behulp van de bright field-modus door te zoeken naar oranjebruin gekleurde ovalen in de slice. Schakel de microscoop over naar confocale beeldvorming door op de CS-knop op de touchscreencontroller van de microscoop te drukken. Als u de eilandjes wilt bekijken met behulp van reflectie, schakelt u de 638-laserdetector en PMT-detector in.
Stel het laservermogen in tussen één en 2% en schakel de inkepingsfilters uit. Gebruik de 405 nanometer laser en PMT detector om de nucleïnezuurvlek te observeren. De hybride detector voor de CD8 antilichaamdetectie en de 488 nanometer laser en hybride detector om het insulinetetrameer te bekijken.
Centreer het interessante eilandje in het gezichtsveld met behulp van de X- en Y-knoppen van de podiumcontroller. Zodra een interessant eilandje zich bevindt, schakelt u over naar het 20X-objectief en zoomt u in, zodat het eilandje het grootste deel van het frame in beslag neemt. Neem een z-stack van het eilandje en zoek vervolgens de beste optische secties waar de cellen leven en eventuele omliggende immuuncellen in focus zijn.
Stel de microscoop in om op te nemen in XYZT-modus en optimaliseer de instellingen om elke 20 minuten een z-stack van de geselecteerde stappen op te nemen gedurende een periode van enkele uren. De eilandjes in een plak pancreasweefsel werden gevisualiseerd met behulp van brightfield en gereflecteerde lichtmicroscopie. De insuline in de eilandjes verhoogt de granulariteit en veroorzaakt absorptie van grote hoeveelheden gereflecteerd licht, waardoor de zichtbaarheid van de eilandjes toeneemt.
De levensvatbaarheid van een levend menselijk pancreasweefsel werd beoordeeld door middel van kleuring. De levende cellen zijn aangegeven in groen en de dode cellen in blauw. Een andere positieve indicator voor levensvatbaarheid is waarneembare basale activiteit.
Wanneer een levende pancreasschijf werd geladen met een celdoorlatende calciumindicator, werd glucosestimulatie waargenomen in zowel muis- als menselijke pancreasplakken. De fluorescentie van individuele cellen tijdens glucosestimulatie werd ook gekwantificeerd. Intacte en zieke eilandjes werden waargenomen met behulp van dithizone-kleuring en gereflecteerde lichtmicroscopie.
De zieke eilandjes beginnen granulariteit te verliezen als gevolg van immuuncelinfiltratie en celdood. Immuuncelpopulaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van CD8-antilichamen en insulinetetrameerkleuring. Co-kleuring geeft aan dat de cellen effector T-cellen zijn die specifiek gericht zijn op het insulineantigeen.
Het meest kritieke om te onthouden in deze procedure is om de plakjes in oplossingen proteaseremmer te allen tijde te houden. Na deze procedure kunnen tal van functionaliteiten in immuuncelexperimenten worden uitgevoerd, waardoor het effect van immuuncelinteracties en eilandjesfunctie kan worden bestudeerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselsnijplaten voor het onderzoek naar eilandjesfysiologie en interacties tussen eilandjes en immuuncellen. De methode maakt het mogelijk om de functionaliteit van de eilandjes te onderzoeken terwijl de natuurlijke micro-omgeving behouden blijft.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Eilandjes van Langerhans spelen een cruciale rol in het glucosemetabolisme.
- Interacties met immuuncellen kunnen de functie van de eilandjes beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze interacties is essentieel voor de aanpak van pancreasziekten.
- Levende weefselsneden behouden de fysiologische context van de cellen.
Doel van de studie
- Om de impact van interacties tussen immuuncellen op de functionaliteit van eilandjes van Langerhans te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in pancreasaandoeningen zoals type I en type II diabetes.
- Om een methode te ontwikkelen die weefselpathologieën en micro-omgevingen behoudt.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van levende pancreasweefselsnijden.
- Gebruik van een vibratoom voor nauwkeurig snijden.
- Toepassing van secondelijm voor stabilisatie van het weefselblok.
- Real-time observatie van interacties tussen eilandjes van Langerhans en immuuncellen.
Belangrijkste resultaten
- De methode van levende pancreasweefselcoupes behoudt effectief de fysiologie van de eilandjes van Langerhans.
- Interacties tussen immuuncellen bleken de functie van de eilandjes van Langerhans significant te beïnvloeden.
- Deze aanpak maakt het mogelijk om onderliggende pathologieën te bestuderen.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan behandelstrategieën voor pancreasaandoeningen.
Conclusies
- Levende plakjes pancreasweefsel zijn een waardevolle tool voor het bestuderen van de fysiologie van de eilandjes van Langerhans.
- De methode kan het begrip van immuuninteracties in de functie van de eilandjes van Langerhans verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om pancreasaandoeningen aan te pakken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Levende plakjes pancreasweefsel maken directe observatie van interacties tussen eilandjes en immuuncellen mogelijk binnen een behouden natuurlijke micro-omgeving, wat een fysiologisch relevant systeem biedt voor mechanische risicoreductie bij de validatie van diabetes-targets. Deze benadering ondersteunt het voorspellende vertrouwen door de weefsellevensvatbaarheid en onderliggende pathologieën, zoals type 1- en type 2-diabetes, te behouden, waardoor R&D-teams therapeutische hypothesen kunnen beoordelen in een ziekterelevante context. De methode slaat een brug tussen discovery biology en translationeel onderzoek door kwantitatieve real-time read-outs van de eilandjesfunctie en immuunceldynamiek te leveren, die cruciaal zijn voor go/no-go-beslissingen in de vroege fase van diabetes-geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de infiltratie van immuuncellen en de directe impact hiervan op de integriteit van eilandjesgranula en de insulineruivrijgave te visualiseren.
- Operationele waarde: Behoudt de oorspronkelijke weefselarchitectuur en cellulaire interacties, waardoor mechanische ambiguïteit bij doelwitvalidatie voor immunomodulerende diabetherstherapieën wordt verminderd.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door immuuncelactiviteit te koppelen aan functionele achteruitgang van de eilandjes, wat een biomarker-gealignerde readout voor target engagement biedt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentiemetingen van calciumindicatoren en insulinetetrameer-kleuringen om dosisafhankelijke effecten van verbindingen op de eilandjesfunctie te beoordelen.
- Operationele waarde: Standardiseert de weefselpreparatie en beeldvormingsprotocollen, waardoor reproduceerbare basismetingen over experimentele runs en modelsystemen worden gegarandeerd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met time-lapse microscopie en z-stack acquisitie, wat longitudinale monitoring van immuunceldynamiek over meerdere uren mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Behoudt onderliggende pathologieën uit menselijk en muizenpancreasweefsel, waardoor mechanismen van type 1 en type 2 diabetes in een ziekterelevant systeem kunnen worden bestudeerd.
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege discovery-bevindingen met preklinische validatie door intercellulaire interacties te behouden die cruciaal zijn voor immuun-gemedieerde eilandjesdysfunctie.
- Risico-geoptimaliseerde vooruitgang: Maakt visualisatie van effector T-celinteracties met insulineantigenen mogelijk via CD8- en insulinetetrameer-co-kleuring, wat mechanisme-gebaseerde go/no-go-beslissingen ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode van levende pancreasweefselsneden past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinisch onderzoek en biedt een ziekterelevant systeem dat de weefsellevensvatbaarheid en de micro-omgeving behoudt voor mechanistische studies naar interacties tussen eilandjes en het immuunsysteem.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door real-time observatie van de impact van immuuncellen op de eilandjesfysiologie mogelijk te maken, waardoor de betrokken paden bij de pathogenese van diabetes worden verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klaar weefselsnijplaten met kwantitatieve output van glucose-gestimuleerde calciumflux en insulinetetrameerbinding, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen faciliteert.
- Analytics: Genereert XYZT time-lapse-gegevens en z-stack optische secties, waardoor teams cellulaire responsen en de lokalisatie van immuuncellen in de tijd kunnen kwantificeren.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt ziekterelevante pathologieën en de natuurlijke micro-omgeving, wat de continuïteit ondersteunt van discovery tot preklinische validatie van immunomodulerende mechanismen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van de eilandjesfunctie over meerdere ziekte-modellen en therapeutische modaliteiten, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij de validatie van targets door mechanische ambiguïteit te verminderen via directe visualisatie van interacties tussen eilandjes en immuuncellen in intact weefsel.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde protocollen voor het snijden, incuberen en imageren die de levensvatbaarheid en functie van de coupes behouden.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door immuuncelactiviteit te koppelen aan functionele achteruitgang van de eilandjes, waardoor biologische risico's in een laat stadium van de ontwikkeling van diabetesmedicatie worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van hun vermogen om immuun-gemedieerde eilandjesdysfunctie te beperken in een ziekte-relevant systeem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, vibratoom-sectie en confocale microscopie voor live-imaging van immuunceldynamiek.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder een vibratoom, een confocale microscoop met laserdetectoren (405nm, 488nm, 638nm) en een stage-top incubator voor omgevingscontrole.
- Vereist cross-team standaardisatie van de coupesvoorbereiding, buffersamenstelling (Krebs-Ringer bicarbonaat met D-glucose en trypsineremmer) en incubatiecondities om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende modelsystemen (mens vs. muis) of ziektestadia (T1D vs. T2D) om de weefsellevensvatbaarheid en pathologische relevantie te behouden.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van protease-remmers om de integriteit van de coupes te behouden en de technische uitdaging om de optische helderheid te bewaren tijdens langdurige time-lapse imaging.
