Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Dit protocol maakt de productie van veilige en efficiënte nanoliposomen mogelijk die kunnen worden gebruikt als transfectievoertuigen voor therapeutisch boodschapperRNA. Deze nanoliposomen vergemakkelijken mRNA opname in cellen wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie niveaus zonder dat de levensvatbaarheid van de cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het snel en eenvoudig genereren van stabiele nanoliposomen met gedefinieerde grootte en homogene distributie.

Bovendien beschermen ze het ingekapselde mRNA tegen afbraak en leiden ze tot langdurige vertaling. Het aantonen van de procedure zal Antonia Link zijn, een promovendus uit ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, bereid voorraad oplossingen voor de lipiden, DC-cholesterol en DOPE door het oplossen van elk in chloroform tot een uiteindelijke concentratie van 25 milligram per milliliter.

Meng 40 microliter van het opgeloste DC-cholesterol met 80 microliter van het opgeloste DOPE in een glazen kolf. Verdampen de chloroform onder een argon gasstroom gedurende 15 minuten. Vul vervolgens een desiccator met silicagel.

Plaats de open glazen kolf binnen en breng 's nachts een vacuüm aan om ervoor te zorgen dat de resterende chloroform verdampt. De resulterende lipide film zal vormen in de glazen kolf. De volgende dag, voeg een milliliter van nuclease gratis water om de lipide film te hydrateren.

En de suspensie gedurende 15 minuten. Plaats de suspensie een uur in een sonicatiebad. Monteer hierna de mini-extruder volgens de instructies van de fabrikant.

Vul een spuit met de vloeibare suspensie en plaats deze aan de ene kant van de extruder. Plaats een lege spuit aan de andere kant. Druk de lipidesveer door het membraan van de ene spuit naar de andere, ongeveer 20-25 keer om de suspensie te extruderen.

Bewaar vervolgens de nanoliposomen in een glazen kolf op vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor gebruik. Ontdooi eerst het synthetische mRNA op ijs. Vortex de bevroren mRNA en vervolgens centrifugeren het kort voor het openen van de buis.

Meng vervolgens een microgram van het synthetische mRNA met verschillende hoeveelheden nanoliposoom suspensie. Centrifuge kort en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten voor nanolipoplex vorming. Voeg vervolgens milliliter van regulier celmedium toe aan de nanolipoplex's en meng door op en neer te pipetten.

Bereid de cellen een dag voor transfectie. Daarom, plaat 150, 000 A549 cellen in elke put van een 12 put plaat een dag voorafgaand aan de transfectie. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en regelmatig celmedium gedurende 24 uur.

Dan de volgende dag, was elke goed van voorbereide cellen een keer met een milliliter PBS. Voeg een milliliter van een bereidnacpoplexmengsel toe aan een van de putten die de A549-cellen bevatten. Incubeer onder regelmatige omstandigheden gedurende 24 uur om de transfectie-efficiëntie te analyseren, of gedurende 24-72 uur om de levensvatbaarheid van de cel na transfectie te analyseren.

Verwijder de supernatant en was elke put met een milliliter PBS om de resterende nanoliposomen te verwijderen. Om de cellen voor te bereiden op cytometrie, voeg eerst 500 microliter trypsin EDTA toe aan elke put en broed je drie minuten lang in bij 37 graden Celsius om de cellen te trypsiniseren. Voeg vervolgens 500 microliters van regulier FBS-bevattend medium toe om het proces te stoppen en de trypsine te inactiveren.

Centrifugeren de cellen op 400 keer G gedurende vijf minuten. En verwijder voorzichtig de supernatant zonder de celpellet te verstoren. Was de cellen met een milliliter PBS.

Stel de cellen vervolgens opnieuw op in 300 microliter celfixatieoplossing en breng ze over in stroomcytriebuizen. Gebruik een stroomcytometer om de cellen op 488 nanometer te analyseren. Om de cellen voor te bereiden op fluorescentie microscopie, voeg een milliliter gekoelde methanol aan elke put om de cellen vast te stellen.

Voeg 500 microliter van een 300 nanomolar oplossing van DAPI opgelost in PBS aan elke put. Vijf minuten in het donker uitbroeden. Verwijder hierna de DAPI-oplossing en was de cellen opnieuw met 100% methanol die eerder bij min 20 graden Celsius werd opgeslagen.

Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de cellen te analyseren met behulp van de excitatie en emissiegolflengten die hier worden getoond. In deze studie worden nanoliposomen gegenereerd met een hoge inkapselingseffectie voor synthetisch gemodificeerd mRNA. Met behulp van de RNA kwantificering kit, de inkapseling werkzaamheid van de nanoliposomen kan worden geanalyseerd na de inkapseling van een microgram van eGFP codering mRNA door het analyseren van de vrije hoeveelheid mRNA die niet is ingekapseld.

Na de inkapseling van EGFP mRNA in verschillende hoeveelheden nanoliposomen, kunnen de gevormde nanolipoplexen worden geïncubeerd met cellen in vitro en het percentage eGFP-uitdrukkende cellen kan worden geanalyseerd met behulp van stroomcytometrie 24 uur na transfectie. Zoals hier te zien, zelfs slechts een microliter van de nanoliposomen oplossing is voldoende om een hoge transfectie van de cellen invitro te bereiken. Wanneer de cellen worden doorfecteerd met nanoliposomen die Cy3-gelabeld eGFP mRNA bevatten, kan de aanwezigheid van het eGFP mRNA in het cytoplasma en het reeds geproduceerde eGFP-eiwit worden gevisualiseerd.

Aangezien de transfectie van cellen met behulp van nanolipoplexen nadelige effecten op cellen kan hebben, werd de levensvatbaarheid van de cellen getest na 24 uur en 72 uur na de transfectie. Er kunnen geen effecten op de levensvatbaarheid van de cel worden gedetecteerd wanneer de cellen werden behandeld met 2,5 of vijf microliter nanolipoplexen. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te werken in een ethanol-vrije omgeving de hele tijd, omdat dit kan schadelijk zijn nanoliposoom stabiliteit.

Tijdens het voorbereiden en mengen van de DC-cholesterol met DOPE, moet u gebruik maken van een glazen pipet om besmetting van de opgeloste lipiden met oplosbare componenten van plastic pipet tips te voorkomen. Volgens dit protocol kunnen de gegenereerde nanoliposomen gemakkelijk worden gemanipuleerd tijdens of na de voorbereiding. Bijvoorbeeld, integratie van PEG moleculen of specifieke antilichamen zou leiden tot meer stabiliteit of initiëren actieve weefsel targeting.

De gegenereerde nanoliposomen voldoen aan de nodige veiligheidsaspecten en vergemakkelijken de opname van mRNA voor de doelcellen. Nanoliposomen, complex met een specifiek therapeutisch nRNA, kunnen een essentiële bijdrage leveren aan de ontwikkeling van nieuwe mRNA-gebaseerde therapieën op het gebied van bijvoorbeeld weefseltechniek of vervangingstherapie.