Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Deze methode kan helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van kandidaat-doelgenen via epigenetische modificaties tijdens schimmelpathogenese in plantenpathologie. Chromatine immunoprecipitatie sequencing technologie kan efficiënt DNA-segmenten detecteren die interageren met histonen en transcriptiefactoren in het hele genoom. In vergelijking met andere methoden kan het de efficiëntie en resolutie verbeteren.

Begin met het toevoegen van 100 microliter vloeibaar volledig medium aan de agger-platen van havermouttomaat met behulp van een pipet van 100 microliter. Schraap met behulp van een inentingslus de mycelia van de wildtype-stam en de knock-out-stam. Verzamel het mycelia-puin en breng ze over naar 250 milliliter vloeibaar volledig medium.

Was de schimmeldraden met 500 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Verzamel vervolgens het schimmel myceliUM en weeg het. Voeg ongeveer één milliliter lysis-enzympermeatieoplossing per gram van het schimmelmycelium toe.

Plaats de schimmeldraden voor het snijden bij 28 graden Celsius gedurende drie tot vier uur met schudden bij 150 RPM. Was de gelicente schimmeldraden met 50 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Centrifugeer het monster en gooi het bovennatuurlijke goed weg.

Suspensie van de protoplast opnieuw in 20 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Voeg druppelsgeopt 55 microliter van 37% formaldehyde toe aan twee milliliter natriumchloridebuffer met protoplasten voor cross-linking totdat de eindconcentratie 1% is Om de niet-gereageerde formaldehyde te dempen, voegt u 20 microliter van 10 keer glycine toe aan elke buis. Gooi het bovennatuurlijk voorzichtig weg na het centrifugeren.

Suspensie van de pellet opnieuw in één milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Gooi het supernatant na het centrifugeren voorzichtig weg en suspensie de pellet opnieuw in 750 microliter RIPA-buffer. Voeg 37,5 microliter 20 maal proteaseremmer toe.

Schuif het chromatine door ultrasoonapparaat gedurende acht minuten met behulp van een ultrasone homogenisator. Nadat het monster ultrasoon is gebroken, neemt u een deel van het monster als invoer met al het DNA en eiwit dat vrijkomt nadat het monster is gesoniseerd. Om de lengte van de DNA-fragmenten te analyseren, voert u een 1% agarose gel-elektroforese uit na ultrasoonapparaat.

Breng na centrifugeren het gecentrifugeerde supernatant over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar deze bij een negatieve 80 graden Celsius voor later gebruik. Voordat u het IP-experiment uitvoert, verdunt u elk chromatinemonster tot een verhouding van één tot 10 met één keer de RIPA-buffer. Pipetteer 50 microliter superparamagnetische eiwitparels in een centrifugebuis van twee milliliter.

Plaats de buisjes op een magnetische standaard en laat de magnetische kralen neerslaan. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg een milliliter voorgekoelde eenmalige RIPA-buffer toe aan de buis en was superparamagnetische eiwitparels drie keer.

Plaats de buizen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant. Voeg 100 microliter van één keer RIPA-buffer toe aan elke buis. Voeg 30 microliter van het chromatinemonster, 100 microliter superparamagnetische eiwitparels en vier microliter H3K4me3-antilichaam toe aan de buis en meng ze goed.

Plaats de monsters op een roterende shaker om ze 's nachts bij vier graden Celsius bij 30 keer G te incuberen.Was het superparamagnetische eiwitkraalantilichaam en chromatinecomplex door de kralen in één milliliter van één keer RIPA-buffer te resuspenderen. Was het monster met één milliliter wasbuffer met een laag zoutgehalte en vervolgens met een milliliter wasbuffer met een hoog zout immuuncomplex. Spoel de kralen af met een milliliter lithiumchloridebuffer en verwijder het supernatant.

Voeg vervolgens een milliliter TE-buffer toe aan de buis. Plaats de buis opnieuw met een milliliter TE-buffer en verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 100 microliter elutiebuffer toe aan elke centrifugebuis.

Voer gedurende 15 minuten elutie uit bij 65 graden Celsius. Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 maal G bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in nieuwe centrifugebuizen. Voeg acht microliter van vijf molair natriumchloride toe aan alle buizen en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende vier tot vijf uur of een nacht om de DNA-eiwitkruisverbindingen om te keren.

Voeg een microliter Rnase A toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vier microliter proteïnase K toe aan elke buis en incubeer bij 45 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Voeg 550 microliter van het fenale chloroform- en isoamylalcoholmengsel toe aan de centrifugebuis.

Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 keer G en aspirateer het supernatant. Voeg 1/10 volume van drie molaire natriumacetaatoplossing, 2,5 volumes absolute ethanol en drie microliter glycogeen toe aan de buis. Plaats het monster 's nachts in een koelkast bij negatief 20 graden Celsius voor neerslag.

Centrifugeer de volgende dag de buizen en gooi het supernatant weg. Was de pellet driemaal met één milliliter vers bereid 75%ethanol op 10.000 maal G.Voeg 50 microliter steriel gedeïoniseerd water toe om het neerslag voldoende op te lossen. Repareer de DNA-uiteinden om stomp DNA te genereren met behulp van een DNA-eindreparatiekit en instructies die in het tekstmanuscript worden vermeld.

Om adeninebasis toe te voegen aan de drie priemeinden, voegt u 30 microliter DNA, twee microliter water, vijf microliter 10 keer Taq-buffer, 10 microliter van één millimolaire dATP en drie microliter Taq DNA-polymerase toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 microliter. Meng ze en reageer in een PCR-machine bij 72 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voer linkerligatie uit door 10 microliter DNA, 9,9 microliter water, 2,5 microliter T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 microliter adapter oligomix en 2,5 microliter T4 DNA-ligase in een PCR-centrifugebuis van 0,2 microliter te mengen.

Incubeer de buis bij 16 graden Celsius gedurende vier uur. Om het DNA te versterken met behulp van PCR-primers, voegt u 10,5 microliter DNA toe, 12,5 microliter van twee keer high fidelity mastermix. één microliter PCR primer PE 1.0 en één microliter PCR primer PE 2.0 tot een 0.2 microliter PCR centrifugebuis en meng goed.

De H3K4me3-signalen van de mobre2-, mospp1- en moswd2-deletiemutanten waren significant afgenomen in de functionele doelgebieden. Vergeleken met de wildtype stam P131 waren de signalen van verrijkte H3K4me3 chromatine immunoprecipitatie sequencing reads in de mobre2, mospp1 en moswd2 deletie mutanten grotendeels afgenomen. Na deze procedure kan chip op chip en chip qPCR worden uitgevoerd.

Ze worden over het algemeen gebruikt om het stroomafwaartse doelgen van een eiwit te screenen en eiwit-DNA-interacties op bekende genoombindingsplaatsen te bestuderen.