Name: Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer genoombrede analyse van histonmodificaties in Magnaporthe oryzae met ChIP-seq. Deze methode identificeert kandidaat-doelgenen en onthult epigenetische regulatie tijdens schimmelpathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), het Special Scientific Research Project van Beijing Agriculture University (YQ201603), het Scientific Project van Beijing Educational Committee (KM201610020005), het High-level scientific research cultivation project van BUA (GJB2021005).

1. Bereiding van protoplasten van M. oryzae
<ol><li>Bereid de havermout-tomatenagar (OTA).<ol>
<li>Weeg 30-50 g havermout en kook het gedurende 20 minuten in 800 ml water (ddH2O). Filtreer door twee lagen gaas en neem het filtraat.</li>
		<li>Pluk rijpe tomaten en schil ze. Pers het sap uit en filter door twee lagen gaas om 150 ml van het gefilterde sap te verzamelen.</li>
		<li>Meng al het tomatensap en het bereide haverfitraat grondig en voeg ddH2O toe tot 1000 ml.</li>
		<li>Voeg 250 ml van de OTA en 2,5 g agarpoeder toe aan een erlenmeyer van 500 ml en autoclaaf gedurende 20 minuten. Bewaren bij 25 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet 25 ml van de geautoclaveerde OTA in een glazen petrischaaltje van 5 cm x 5 cm. Bereid in totaal 10 van deze petrischaaltjes. Nadat de OTA op de petrischaaltjes is gestold, bewaar je de schalen ondersteboven bij 25 °C.</li>
	<li>Gebruik een gesteriliseerde tandenstoker om een klein stukje mycelium uit M. oryzae (de wild-type soort P131, knock-out stammen Δmobre2, Δmospp1 en Δmoswd2) uit te graven en plaats ze op de bereide OTA-gerechten. Kweek ze gedurende 4-6 dagen bij 28 °C onder lichtomstandigheden. OPMERKING: Draai de petrischaal ondersteboven om vervuiling te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 1000 μL vloeibaar Volledig Medium (CM) (0,6% gistextract, 0,3% enzymatisch caseïnehydrolysaat, 0,3% zure caseïnehydrolysaat, 1% glucose) toe aan de OTA-schotels met behulp van een pipet van 1000 μL. OPMERKING: De schimmeldraden groeiden op de OTA-gerechten gedurende 4-6 dagen.</li>
	<li>Schraap de mycelia van de wild-type stam en knock-out stam met een inentingslus.</li>
	<li>Verzamel het mycelia-vuil en breng ze over in 250 ml vloeibaar Complete Medium (CM).</li>
	<li>Kweek het schimmelafval in een driehoekige kolf bij 28 °C gedurende 36 uur met schudden bij 150 tpm.</li>
	<li>Gebruik een trechter om de schimmeldraden te filteren en te verzamelen.</li>
	<li>Was de schimmeldraden met 500 ml 0,7 M NaCl-oplossing.</li>
	<li>Verzamel het schimmelmycelium en weeg het. OPMERKING: Het mycelium hoeft niet te worden gedroogd voordat het wordt gewogen.</li>
	<li>Voeg ~1 ml lysis-enzympermeatieoplossing toe per 1 g van het schimmelmycelium.<ol>
<li>Bereid de 20 mg/ml lysis-enzympermeatieoplossing door het lysis-enzym van Trichoderma harzianum op te lossen in 0,7 M NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de schimmeldraden om 3-4 uur bij 28 °C te liggen met schudden bij 150 tpm.</li>
	<li>Was de gelyseerde schimmeldraden met 50 ml 0,7 M NaCl-oplossing.</li>
	<li>Verzamel de protoplasten en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.</li>
	<li>Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de protoplasten in 20 ml van 0,7 M NaCI-buffer bij 4 °C.</li>
</ol>2. In vivo crosslinking en ultrasoonapparaat
<ol><li>Voeg 55 μL 37% formaldehyde (voeg formaldehyde druppel voor druppel toe tot de uiteindelijke concentratie 1%) is aan 2 ml NaCI-buffer met protoplast voor crosslinking.</li>
	<li>Incubeer de protoplasten bij 25 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Voeg 20 μL 10x glycine toe aan elke buis om de niet-gereageerde formaldehyde te dempen.</li>
	<li>Wervel om te mengen en incubeer bij 25 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.</li>
	<li>Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de pellet in 1 ml 0,7 M NaCI-oplossing.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.</li>
	<li>Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de pellet in 750 μL RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholieaat, 0,1% SDS en proteaseremmers).</li>
	<li>Voeg 37,5 μL 20x proteaseremmer toe.</li>
	<li>Breng de protoplasten van de vorige stap over naar een centrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voer ultrasoonapparaat (25% W, uitgang 3 s, stop 5 s, 4 °C) onmiddellijk uit met een sonicator gedurende ongeveer 10 minuten. Het doel van deze stap is om het vertwijfde lysaat gedurende een bepaalde periode te soniceren om de beste omstandigheden te bepalen. OPMERKING: Het lysaat kan in deze stap worden ingevroren bij -80 °C.</li>
	<li>Als de optimale omstandigheden voor ultrasoonapparaat al zijn bepaald, gaat u verder met de volgende stap.</li>
	<li>Verwijder indien gewenst 5 μL protoplasten voor agarosegelanalyse (ongehoord DNA).</li>
	<li>Schuif het chromatine door ultrasoonapparaat met een ultrasone homogenisator gedurende 8 minuten (25% W, uitgang 3 s, stop 5 s, 4 °C).</li>
	<li>Nadat het monster ultrasoon is gebroken, neemt u een deel van het monster als "invoer". De invoer voert het ChIP-experiment niet uit en bevat al het DNA en eiwit dat vrijkomt nadat het monster is gesonificeerd.</li>
	<li>Voer na ultrasoonapparaat een 1% agarose gel-elektroforese uit om de lengte van de DNA-fragmenten te analyseren. OPMERKING: De agarose gel elektroforese resultaten tonen aan dat de lengte van het DNA-fragment 200-500 bp is(figuur 4).</li>
	<li>Plaats de gesonificeerde buis op ijs om eiwitafbraak te voorkomen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en 4 °C.</li>
	<li>Breng na het centrifugeren het gecentrifugeerde supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze bij -80 °C voor later gebruik. De chromatineoplossing die in deze stap wordt verkregen, kan worden gebruikt voor latere IP.</li>
	<li>Voordat u het IP-experiment uitvoert, verdunt u elk chromatinemonster tot een verhouding van 1:10 met 1x RIPA-buffer (voeg bijvoorbeeld 10 μL chromatinemonster toe aan 1 μL 1×RIPA-buffer).</li>
</ol>3. IP van verknoopt eiwit/DNA
<ol><li>Pipetteer 50 μL superparamagnetische eiwitparels in een centrifugebuis van 2 ml. Plaats de buizen op een magnetische standaard. Laat de magnetische kralen neerslaan. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Voeg 1 ml 1x RIPA-buffer (voorgekoeld op ijs) toe aan de buis en was driemaal superparamagnetische eiwitparels. Plaats na de was de buizen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant. Voeg 100 μL 1x RIPA-buffer toe aan elke buis.</li>
	<li>Voeg 300 μL chormatinemonster (2 x 107 cellen werden gebruikt), 100 μL superparamagnetische eiwitparels en 4 μL H3K4me3-antilichaam toe aan de buis.</li>
	<li>Gebruik monsters met Muis IgG als negatief besturingselement. OPMERKING: Muis IgG gebruikt in dit protocol bevat 0,01 M fosfaatbuffer en 0,15 M NaCl, en blijft bevroren onder 20 °C (zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Plaats de monsters na goed mengen op een roterende shaker en incubeer een nacht bij 4 °C, 30 x g. OPMERKING: Het kan mogelijk zijn om de incubatietijd van de immunoprecipitatie (IP) te verkorten. De incubatietijd is afhankelijk van verschillende factoren (bijv. het antilichaam, gendoel, celtype, enz.) en moet empirisch worden getest.</li>
</ol>4. Verzamelen en spoelen van de IP-producten
<ol><li>Pellet de superparamagnetische eiwitkorrels door ze op een magnetische standaard te plaatsen. Aspirateer en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was het superparamagnetische eiwitkraal-antilichaam/chromatinecomplex door de kralen opnieuw op te suspenderen in 1 ml ripa-buffer.</li>
	<li>Spoel de tube gedurende 5 minuten af op een roterende shaker en verwijder het supernatant bij 30 x g.</li>
	<li>Voeg 1 ml wasbuffer met een laag zoutafweercomplex toe (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 en 150 mM NaCl).</li>
	<li>Spoel de tube gedurende 5 minuten af op een roterende shaker en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Voeg 1 ml wasbuffer met een hoog zoutgehalte (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 en 500 mM NaCl) toe aan de centrifugebuis.</li>
	<li>Plaats de tube gedurende 5 minuten op een roterende shaker en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Spoel met 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholzuur, 1 mM EDTA en 10 mM Tris-HCl pH 8,1) in de centrifugebuis.</li>
	<li>Plaats de tube gedurende 5 minuten op een roterende shaker en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Spoel de reageerbuis opnieuw af met 1 ml 0,25 M LiCI-buffer, verwijder het supernatant met een pipet en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 1 ml TE-buffer toe (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Plaats de tube op een roterende shaker gedurende 5 min bij 30 x g.</li>
	<li>Was de tube opnieuw met 1 ml TE-buffer en verwijder het supernatant met een pipet.</li>
	<li>Verzamel de kralen.</li>
</ol>5. Elutie van eiwit/DNA-complexen
<ol><li>Bereid de elutiebuffer (10 μL van 20% SDS, 20 μL van 1 M NaHCO3,170 μL steriel gedestilleerd H2O) voor alle IP- en ingangsbuizen.</li>
	<li>Voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elke centrifugebuis.</li>
	<li>Elutie bij 65 °C gedurende 15 min.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g en 4 °C en vang het supernatant op in nieuwe centrifugebuizen.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2 - 5.4 en combineer de eluaten. Voeg 190 μL elutiebuffer toe aan de 10 μL van het input-DNA. (totaal volume = 200 μL).</li>
</ol>6. Reverse crosslinking van eiwit/DNA-complexen
<ol><li>Voeg 8 μL van 5 M NaCl toe aan alle buisjes en incubeer bij 65 °C gedurende 4-5 uur of 's nachts om de DNA-eiwit crosslinks om te keren. OPMERKING: Bewaar de monsters na deze stap bij -20 °C en ga indien nodig de volgende dag verder met het protocol.</li>
	<li>Voeg 1 μL RNase A toe en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 4 μL Proteïnase K (opgelost in H2O bij 20 mg/ml en bewaard bij -20 °C) toe aan elke buis en incubeer bij 45 °C gedurende 1-2 uur.</li>
</ol>7. Zuivering en herstel van DNA
<ol><li>Voeg 550 μL fenol/chloroform/isoamylalcoholmengsel (verhouding van 25:24:1) toe aan de centrifugebuis.</li>
	<li>Vortex het mengsel grondig gedurende 1 min.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g en aspirateer het supernatant.</li>
	<li>Breng het geëxtraheerde supernatant uit de vorige stap over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaatoplossing, 2,5 volumes absolute ethanol en 3 μL glycogeen (20 mg/ml) toe aan de buis.</li>
	<li>Plaats het monster 's nachts in een koelkast bij -20 °C voor neerslag.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g en 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant na het centrifugeren weg. Was de pellet drie keer met 1 ml 75% ethanol (moet vers worden bereid) op 10.000 x g.</li>
	<li>Leg het gewassen neerslag op een schone bank om de alcohol te laten drogen.</li>
	<li>Voeg 50 μL steriel gedeïeniseerd H2O toe om het neerslag voldoende op te lossen.</li>
	<li>Ligate de sequencing-adapter naar het DNA-fragment en gebruik een high-throughput sequencingplatform om het DNA te sequencen.</li>
</ol>8. DNA-reparatie en Solexa bibliotheekconstructie
<ol><li>Repareer de DNA-uiteinden om stomp DNA te genereren met behulp van een DNA-eindreparatiekit (1-34 μL DNA, 5 μL 10x eindherstelbuffer, 5 μL van 2,5 mM elk dNTP, 5 μL van 10 mM ATP, 1 μL eindreparatie-enzymmix en H2O om het reactievolume aan te passen tot 49 μL).</li>
	<li>Gebruik een PCR-zuiveringskit of fenol: chloroformextractie om het DNA te zuiveren. Eluteer of resuspend het DNA in 30 μL van 1x TE pH 7,4.</li>
	<li>Voeg "A" toe aan 3' uiteinden (30 μL DNA uit stap 2, 2 μL H2O, 5 μL 10x Taq buffer, 10 μL 1 mM dATP en 3 μL Taq DNA polymerase). Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml, meng goed en reageer gedurende 10 minuten in een PCR-machine bij 72 °C.</li>
	<li>Voer linkerligatie uit door 10 μL DNA, 9,9 μL H2O, 2,5 μL T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 μL adapter oligomix en 2,5 μL T4 DNA-ligase te mengen. Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml en meng goed. Incubeer ze bij 16 °C gedurende 4 uur.</li>
	<li>Zuiver het DNA met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant. Eluen met 20-25 μL elutiebuffer.</li>
	<li>Voordat de DNA-bibliotheek wordt vastgesteld, identificeert u de concentratie van het gezuiverde DNA om het gebruik ervan voor de daaropvolgende sequencing-experimenten te bevestigen.</li>
	<li>Detecteer de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. Nadat het monster op ijs is gesmolten, mengt u het grondig en centrifugeert u gedurende 30 s bij 1000 x g en 4 °C. Neem vervolgens een geschikte hoeveelheid monster en meet het in een fluorometer met een golflengte van 260 nm.</li>
	<li>Plaats DNA-monsters met gekwalificeerde kwaliteit en concentratie op het Illumina-sequencingplatform voor sequencing.</li>
	<li>Voordat u gaat sequentiëren, versterkt u het DNA met behulp van PCR-primers, PE1.0 en PE2.0 en 2x high-fidelity mastermix (10,5 μL DNA, 12,5 μL 2x high fidelity mastermix, 1 μL PCR-primer PE1.0 en 1 μL PCR-primer PE2.0). Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml en meng goed.</li>
	<li>Voer de PCR-reactie uit in de PCR-machine: 95 °C predenaturatie gedurende 2 minuten; vervolgens 35 cycli van 95 °C denaturatie gedurende 10 s, gloeien bij 60 °C gedurende 15 s, verlenging bij 72 °C gedurende 5 s; een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. Incubeer ten slotte de reactie bij 4 °C.</li>
	<li>Gebruik het DNA voor clustergeneratie en voer sequencing-by-synthesis uit op een Illumina Hiseq 2000. OPMERKING: In dit protocol werden Illumina-stroomcellen gebruikt voor het genereren van clusters. De sequencing-by-synthesis werd uitgevoerd op een Illumina Genome Analyzer volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li>
<li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li>
<li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+%28H3K4%29+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li>
<li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination%3A+triggering+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li>
<li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520(2020).</li>
<li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li>
<li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MoSET1+%28histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae%29+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385(2015).</li>
<li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li>
<li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+trail+of+a+cereal+killer%3A+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth%2C+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li>
<li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+infection+test%3A+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916(2013).</li>
<li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CclA%2C+required+for+histone+3+lysine+4+methylation%2C+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4(2013).</li>
<li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li>
<li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases%3A+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li>
<li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Onlangs is ChIP-seq een veelgebruikte genomische analysemethode geworden voor het bepalen van de bindingsplaatsen van TFs of verrijkingsplaatsen die zijn gewijzigd door specifieke histonen. Vergeleken met eerdere ChIP-seq-technologie is de nieuwe ChIP-seq-technologie zeer gevoelig en flexibel. Resultaten worden geleverd in hoge resolutie zonder negatieve effecten, zoals het ruissignaal veroorzaakt door de niet-specifieke hybridisatie van nucleïnezuren. Hoewel dit een veel voorkomende genexpressieanalyse is, zijn veel com...

Epigenetica is een tak van genetisch onderzoek die verwijst naar de erfelijke verandering van genexpressie zonder de nucleotidesequentie van genen te veranderen. Een toenemend aantal studies heeft aangetoond dat epigenetische regulatie een belangrijke rol speelt bij de groei en ontwikkeling van eukaryote cellen, waaronder chromatine dat genexpressie reguleert en beïnvloedt door het dynamische proces van vouwen en assembleren in structuren van hogere orde1,2. Chromatineremodellering en covalente histonmodificatie beïnvloeden en reguleren de functie en structuur van chromatine door de variatie van chromatinepolymeren, waardoor de functie van het reguleren van genexpressie3,4,5,6wordt bereikt. Posttranslatiele modificaties van histon omvatten acetylering, fosforylering, methylatie, monoubiquitinatie, sumylering en ADP ribosylatie7,8,9. Histon H3K4-methylatie, met name trimethylatie, is in kaart gebracht op transcriptiestartplaatsen waar het wordt geassocieerd met transcriptiereplicatie, recombinatie, reparatie en RNA-verwerking in eukaryoten10,11.
ChIP-seq-technologie werd geïntroduceerd in 2007 en is de experimentele standaard geworden voor de genoombrede analyse van transcriptionele regulatie en epigenetische mechanismen12,13. Deze methode is geschikt op genoombrede schaal en voor het verkrijgen van histon- of transcriptiefactorinteractie-informatie, inclusief DNA-segmenten van DNA-bindende eiwitten. Alle DNA-sequenties die zijn gekoppeld aan interessante eiwitten, zullen samen neerslaan als onderdeel van het chromatinecomplex. Sequencingtechnieken van de nieuwe generatie worden ook gebruikt om 36-100 bp DNA te sequencen, die vervolgens worden gematcht met het overeenkomstige doelgenoom.
In fytopathogene schimmels is onlangs onderzoek begonnen om te bestuderen hoe histonmethylatiemodificaties hun doelgenen reguleren in het proces van pathogeniciteit. Sommige eerdere studies bewezen dat de regulatie van histonmethylase-gerelateerde genen voornamelijk wordt weerspiegeld in gen-uitschakeling en katalysering van de productie van secundaire metabolieten (SM). MoSet1 is de H3K4 methylase in M. oryzae. Knock-out van dit gen resulteert in de volledige deletie van H3K4me3 modificatie14. Vergeleken met de wild-type stam, de expressie van het gen MoCEL7C in de mutant wordt geremd in de CMC-geïnduceerde toestand en in de niet-geïnduceerde toestand (glucose of cellobiose), de expressie van MoCEL7C verhoogd15. In Fusarium graminearumkan KMT6 de methylatiemodificatie van H3K27me3 katalyseren, de normale ontwikkeling van schimmels reguleren en helpen bij het reguleren van het "cryptische genoom" dat het SM-gencluster16,17,18,19bevat. In 2013 meldde Connolly dat H3K9- en H3K27-methylatie het pathogene proces van schimmels reguleert via secundaire metabolieten en effectorfactoren die de remming van doelgenen reguleren20. In Aspergillusis de modificatie van histonen H3K4me2 en H3K4me3 gerelateerd aan genactivering en speelt een belangrijke rol bij het beheersen van de chromatineniveauregulatie van SM-genclusters21. In M. oryzaeis Tig1 (homoloog aan Tig1 bij gist en zoogdieren) een HADC (histon deacetylase)22. Knock-out van het Tig1-gen leidt tot het volledige verlies van pathogeniciteit en sporenproductievermogen in de nulmutant. Het is gevoeliger voor een peroxygeenomgeving, die geen infectieuze schimmeldraden kan produceren22.
De rijstexplosie veroorzaakt door M. oryzae. is een van de ernstigste rijstziekten in de meeste rijstteeltgebieden ter wereld19. Vanwege het representatieve infectieproces is M. oryzae vergelijkbaar met het infectieproces van veel belangrijke pathogene schimmels. Omdat het gemakkelijk moleculair genetische operaties kan uitvoeren, is de schimmel een modelorganisme geworden voor het bestuderen van schimmel-plantinteracties23. Het blokkeren van elke stap van het infectieproces van M. oryzae kan leiden tot een mislukte infectie. De morfologische veranderingen tijdens het infectieproces worden strikt gereguleerd door de gehele genoomfunctie en gentranscriptie. Onder hen spelen epigenetische modificaties zoals histonmethylatie een essentiële rol in de transcriptionele regulatie van functionele genen24,25. Tot nu toe zijn er echter weinig studies gedaan naar het moleculaire mechanisme van epigenetische modificaties zoals histonmethylatie en histonacetylering in de transcriptie van pathogenesegenen in M. oryzae. Daarom zal de verdere ontwikkeling van het epigenetische regulatiemechanisme van de rijststraalschimmel, terwijl onderzoek wordt gedaan naar het upstream- en downstream-regulerende netwerk van deze pathogene gerelateerde genen, helpen bij het ontwikkelen van strategieën voor het voorkomen en beheersen van rijststralen.
Met de ontwikkeling van functionele genomica zoals ChIP-seq, vooral in de epigenetica, heeft deze high-throughput data-acquisitiemethode het onderzoek naar chromosomen versneld. Met behulp van de ChIP-seq experimentele technologie kan de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae en andere filamenteuze schimmels worden geïdentificeerd. Daarom kan deze methode helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hoe epigenetische modificaties hun kandidaat-doelgenen reguleren tijdens schimmelpathogenese in plantenpathologie.

<table><tbody><tr><td>acidic casein hydrolysate</td><td>WAKO</td><td>65072-00-6</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>agar powder</td><td>scientan</td><td>9002-18-0</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>deoxycholic acid</td><td>MedChemExpress</td><td>83-44-3</td><td>eiwit en oplossing</td></tr><tr><td>DNA End-Repair kit</td><td>NovoBiotec</td><td>ER81050</td><td>Reparatie van DNA of cDNA beschadigd door enzymatische of mechanische afbraak</td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>nr.100.02D</td><td>Bindend doelwit</td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>JIMEI</td><td>JC2174</td><td>Membraan en vloeistof</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9912</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>enzymatic casein hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>91079-40-2</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>glycogeen</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Bezinkende actie</td></tr><tr><td>H3K4me3 antilichamen</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Immuunrespons op H3K4me3-eiwit</td></tr><tr><td>illumina Genome Analyzer</td><td>illumina</td><td>illumina Hiseq 2000</td><td>Grote configuratie</td></tr><tr><td>Illumina PCR primers</td><td>illumina</td><td>CleanPlex</td><td>Willekeurige universele primer</td></tr><tr><td>isoamyl alcohol</td><td>chemisch boek</td><td>30899-19-5</td><td>Gezuiverd DNA</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9480</td><td>specifieke verwijdering RNA</td></tr><tr><td>lyse-enzymen</td><td>Sigma</td><td>L1412-10G</td><td>cel-lyse buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Yeasen</td><td>36111ES10</td><td>Normaal dierlijk immunoglobuline</td></tr><tr><td>NaCl-oplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>7647-14-5</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Seebio</td><td>SH30173.08*</td><td>bereiding van eiwitcomplex eluent</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td>cel-lysaat om cel-lyse te bevorderen</td></tr><tr><td>PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>De zuiveringsprocedure verwijdert primers uit DNA-monsters</td></tr><tr><td>proteaseremmers</td><td>ThermoFisher</td><td>A32965</td><td>Een eiwitremmer die de eiwitactiviteit vermindert</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2546</td><td>DNA-extractiereagens</td></tr><tr><td>Qubit 4.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td><td>Medium configuratie</td></tr><tr><td>RIPA-buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>9806S</td><td>cel-lyse buffer</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2271</td><td>Gezuiverd DNA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9820</td><td>de ladingsverschillen verbergen</td></tr><tr><td>natriumacetaatoplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>R1181</td><td>Acetazuurbuffer</td></tr><tr><td>natriumdeoxycholaat</td><td>ThermoFisher</td><td>89904</td><td>remming van protease-afbraak</td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0011</td><td>Onder de voorwaarde van ATP als co-enzym, DNA-ligase</td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B69</td><td>DNA-ligase buffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>ThermoFisher</td><td>1185-53-1</td><td>bufferactie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>HFH10</td><td>het membraaneiwit stabiel houden</td></tr><tr><td>gistextract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Medium configuratie</td></tr></tbody></table>

genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Chromatine immunoprecipitatie sequencing (ChIP-seq) is een krachtige en veel gebruikte moleculaire techniek voor het in kaart brengen van hele genoomlocaties van transcriptiefactoren (TF's), chromatineregulatoren en histonmodificaties, evenals het detecteren van volledige genomen voor het blootleggen van TF-bindingspatronen en histon posttranslatiele modificaties. Chromatinemodificerende activiteiten, zoals histonmethylatie, worden vaak gerekruteerd voor specifieke genregulerende sequenties, waardoor gelokaliseerde veranderingen in chromatinestructuren ontstaan en resulteren in specifieke transcriptionele effecten. De rijstexplosie is een verwoestende schimmelziekte op rijst over de hele wereld en is een modelsysteem voor het bestuderen van schimmel-plantinteractie. De moleculaire mechanismen in hoe de histonmodificaties hun virulentiegenen in Magnaporthe oryzae reguleren, blijven echter ongrijpbaar. Meer onderzoekers moeten ChIP-seq gebruiken om te bestuderen hoe histon epigenetische modificatie hun doelgenen reguleert. ChIP-seq wordt ook veel gebruikt om de interactie tussen eiwit en DNA in dieren en planten te bestuderen, maar het wordt minder gebruikt op het gebied van plantenpathologie en is niet goed ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we het experimentele proces en de werkwijze van ChIP-seq om de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3) te identificeren die bindt aan de functionele doelgenen in M. oryzae. Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Het volledige stroomschema van de ChIP-seq methode is weergegeven in figuur 1. ChIP-seq-experimenten werden uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen H3K4me3 in de wild-type stam P131 en drie nulmutante stammen die verstoken waren van mobre2, mospp1en moswd2 gen om het hele genoombrede profiel van histon H3K4me3 distributie in M. oryzaete verifiëren. De protoplasten van de wildtype stam, Δmobre2, Δmospp1en Δmoswd2, werden bere...

Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Deze methode kan helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van kandidaat-doelgenen via epigenetische modificaties tijdens schimmelpathogenese in plantenpathologie. Chromatine immunoprecipitatie sequencing technologie kan efficiënt DNA-segmenten detecteren die interageren met histonen en transcriptiefactoren in het hele genoom. In vergelijking met andere methoden kan het de efficiëntie en resolutie verbeteren.Begin met het toevoegen van 100 microliter vloeibaar volledig medium aan de agger-platen van havermouttomaat met behulp van een pipet van 100 microliter. Schraap met behulp van een inentingslus de mycelia van de wildtype-stam en de knock-out-stam. Verzamel het mycelia-puin en breng ze over naar 250 milliliter vloeibaar volledig medium.Was de schimmeldraden met 500 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Verzamel vervolgens het schimmel myceliUM en weeg het. Voeg ongeveer één milliliter lysis-enzympermeatieoplossing per gram van het schimmelmycelium toe.Plaats de schimmeldraden voor het snijden bij 28 graden Celsius gedurende drie tot vier uur met schudden bij 150 RPM. Was de gelicente schimmeldraden met 50 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Centrifugeer het monster en gooi het bovennatuurlijke goed weg.Suspensie van de protoplast opnieuw in 20 milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Voeg druppelsgeopt 55 microliter van 37% formaldehyde toe aan twee milliliter natriumchloridebuffer met protoplasten voor cross-linking totdat de eindconcentratie 1% is Om de niet-gereageerde formaldehyde te dempen, voegt u 20 microliter van 10 keer glycine toe aan elke buis. Gooi het bovennatuurlijk voorzichtig weg na het centrifugeren.Suspensie van de pellet opnieuw in één milliliter 0,7 molaire natriumchlorideoplossing. Gooi het supernatant na het centrifugeren voorzichtig weg en suspensie de pellet opnieuw in 750 microliter RIPA-buffer. Voeg 37,5 microliter 20 maal proteaseremmer toe.Schuif het chromatine door ultrasoonapparaat gedurende acht minuten met behulp van een ultrasone homogenisator. Nadat het monster ultrasoon is gebroken, neemt u een deel van het monster als invoer met al het DNA en eiwit dat vrijkomt nadat het monster is gesoniseerd. Om de lengte van de DNA-fragmenten te analyseren, voert u een 1% agarose gel-elektroforese uit na ultrasoonapparaat.Breng na centrifugeren het gecentrifugeerde supernatant over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar deze bij een negatieve 80 graden Celsius voor later gebruik. Voordat u het IP-experiment uitvoert, verdunt u elk chromatinemonster tot een verhouding van één tot 10 met één keer de RIPA-buffer. Pipetteer 50 microliter superparamagnetische eiwitparels in een centrifugebuis van twee milliliter.Plaats de buisjes op een magnetische standaard en laat de magnetische kralen neerslaan. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg een milliliter voorgekoelde eenmalige RIPA-buffer toe aan de buis en was superparamagnetische eiwitparels drie keer.Plaats de buizen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant. Voeg 100 microliter van één keer RIPA-buffer toe aan elke buis. Voeg 30 microliter van het chromatinemonster, 100 microliter superparamagnetische eiwitparels en vier microliter H3K4me3-antilichaam toe aan de buis en meng ze goed.Plaats de monsters op een roterende shaker om ze 's nachts bij vier graden Celsius bij 30 keer G te incuberen.Was het superparamagnetische eiwitkraalantilichaam en chromatinecomplex door de kralen in één milliliter van één keer RIPA-buffer te resuspenderen. Was het monster met één milliliter wasbuffer met een laag zoutgehalte en vervolgens met een milliliter wasbuffer met een hoog zout immuuncomplex. Spoel de kralen af met een milliliter lithiumchloridebuffer en verwijder het supernatant.Voeg vervolgens een milliliter TE-buffer toe aan de buis. Plaats de buis opnieuw met een milliliter TE-buffer en verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 100 microliter elutiebuffer toe aan elke centrifugebuis.Voer gedurende 15 minuten elutie uit bij 65 graden Celsius. Centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 maal G bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in nieuwe centrifugebuizen. Voeg acht microliter van vijf molair natriumchloride toe aan alle buizen en incubeer bij 65 graden Celsius gedurende vier tot vijf uur of een nacht om de DNA-eiwitkruisverbindingen om te keren.Voeg een microliter Rnase A toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vier microliter proteïnase K toe aan elke buis en incubeer bij 45 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Voeg 550 microliter van het fenale chloroform- en isoamylalcoholmengsel toe aan de centrifugebuis.Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 keer G en aspirateer het supernatant. Voeg 1/10 volume van drie molaire natriumacetaatoplossing, 2,5 volumes absolute ethanol en drie microliter glycogeen toe aan de buis. Plaats het monster 's nachts in een koelkast bij negatief 20 graden Celsius voor neerslag.Centrifugeer de volgende dag de buizen en gooi het supernatant weg. Was de pellet driemaal met één milliliter vers bereid 75%ethanol op 10.000 maal G.Voeg 50 microliter steriel gedeïoniseerd water toe om het neerslag voldoende op te lossen. Repareer de DNA-uiteinden om stomp DNA te genereren met behulp van een DNA-eindreparatiekit en instructies die in het tekstmanuscript worden vermeld.Om adeninebasis toe te voegen aan de drie priemeinden, voegt u 30 microliter DNA, twee microliter water, vijf microliter 10 keer Taq-buffer, 10 microliter van één millimolaire dATP en drie microliter Taq DNA-polymerase toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 microliter. Meng ze en reageer in een PCR-machine bij 72 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voer linkerligatie uit door 10 microliter DNA, 9,9 microliter water, 2,5 microliter T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 microliter adapter oligomix en 2,5 microliter T4 DNA-ligase in een PCR-centrifugebuis van 0,2 microliter te mengen.Incubeer de buis bij 16 graden Celsius gedurende vier uur. Om het DNA te versterken met behulp van PCR-primers, voegt u 10,5 microliter DNA toe, 12,5 microliter van twee keer high fidelity mastermix. één microliter PCR primer PE 1.0 en één microliter PCR primer PE 2.0 tot een 0.2 microliter PCR centrifugebuis en meng goed.De H3K4me3-signalen van de mobre2-, mospp1- en moswd2-deletiemutanten waren significant afgenomen in de functionele doelgebieden. Vergeleken met de wildtype stam P131 waren de signalen van verrijkte H3K4me3 chromatine immunoprecipitatie sequencing reads in de mobre2, mospp1 en moswd2 deletie mutanten grotendeels afgenomen. Na deze procedure kan chip op chip en chip qPCR worden uitgevoerd.Ze worden over het algemeen gebruikt om het stroomafwaartse doelgen van een eiwit te screenen en eiwit-DNA-interacties op bekende genoombindingsplaatsen te bestuderen.

genome-wide-analysis-histone-modifications-distribution-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Onze Bayesiaanse Change Point (BCP) algoritme is gebaseerd op state-of-the-art ontwikkelingen in het modelleren change-punten via Hidden Markov Models en past deze toe op chromatine immunoprecipitatie sequencing (ChIPseq) data-analyse. BCP presteert goed in zowel brede en punctata data types, maar blinkt uit in nauwkeurig identificeren van robuuste, reproduceerbare eilanden van diffuse histon verrijking.

A Novel Bayesiaanse Change-point algoritme voor Genoom-brede analyse van diverse ChIPseq Data Types

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

We presenteren een gemodificeerde inheemse chromatine immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodologie voor de generatie van reeks datasets geschikt voor een nucleosoom dichtheid ChIP-seq analytisch kader integreren toegankelijkheid micrococcal nuclease (MNase) met Histon wijziging metingen.

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Leer genoombrede analyse van histonmodificaties in Magnaporthe oryzae met ChIP-seq. Deze methode identificeert kandidaat-doelgenen en onthult epigenetische regulatie tijdens schimmelpathogenese.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae (Video) | JoVE Journal

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Meer video's verkennen