Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Menselijke embryonale stamcel-afgeleide hepatocyt-achtige cellen zijn nuttig bij ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Dit is een efficiënte en reproduceerbare methode om de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen in functionele hepatocyt-achtige cellen effectief te induceren. Een ongedifferentieerde status en een geschikte samenvloeiing van menselijke embryonale stamcellen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle differentiatie van hepatocytenachtige cellen.

Voor stamcelonderhoud, bedek steriele zes-put weefsel cultuur behandelde platen met een milliliter van 1X menselijke embryonale stamcel-gekwalificeerde Matrigel per put, en bewaar ze op vier graden Celsius 's nachts. Laat de platen voor gebruik 30 minuten op kamertemperatuur staan. Ontdooi de cryo-geconserveerde HESE's gedurende drie minuten in een waterbad van 37 graden Celsius zonder te schudden en breng de stamcellen onmiddellijk over door ze in een centrifugebuis van 15 milliliter te gieten met vier milliliter voorverwarmd, 37 graden Celsius mTESR-medium.

Centrifugeer de HESE's en aspireer het supernatant en strek de cellen vervolgens voorzichtig opnieuw op in een milliliter mTESR-medium. Aspireer het DMEM F-12 medium van de plaat. Zaai de cellen in een plaat met zes putten met een dichtheid van 1 x 10 tot de 5e cellen in twee milliliter mTESR en incubeer in een incubator van 5% kooldioxide.

Onderhoud de cellen door het medium dagelijks te vervangen door voorverwarmd mTESR-medium. Passage de cellen op ongeveer 70 tot 80% samenvloeiing, of wanneer de celkolonies contact beginnen te maken. Voor cellen die passeren, aspireer het medium en incubeer de cellen met één milliliter per put enzymoplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Breng de cellen over door ze in een centrifugebuis van 15 milliliter te gieten met vier milliliter DMEM F-12 voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Bereid 24-put platen voor door ze te coaten met 250 microliters van 1X hESC-gekwalificeerd Matrigel medium. Zaad hESC's met een dichtheid van 1 tot 1,5 keer 10 tot de 5e cel per put in 500 microliters mTESR medium.

Voeg beide activine A toe aan een eindconcentratie van 100 nanogram per milliliter en CHIR99021 aan een eindconcentratie van drie micromolaren in een geschikt volume voorverwarmd basismedium voor fase één differentiatie. Na drie dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen markers van definitieve endodermcellen uitdrukken, zoals FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 en FOXA1. Op dag drie van differentiatie, aspireer het medium, vervang het door fase twee medium en incubeer gedurende 24 uur.

Verander het medium om de andere dag op dag vier tot en met acht. Na acht dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen geschikte markers van hepatische voorlopercellen uitdrukken, zoals HNF4-alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. Op dag acht, aspireer het stadium twee medium uit de cellen, en vervang het door fase drie medium.

Laat cellen 10 dagen incuberen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide-incubator en verander de media om de andere dag met vers toegevoegde differentiatiefactoren. Na 18 dagen differentiatie moeten gedifferentieerde cellen karakteristieke markers van hepatocyten uitdrukken, zoals AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Het schematische diagram van hepatocyt-achtige cellen uit hESC's en heldere veldafbeeldingen van elke differentiatiefase worden weergegeven.

In fase één werden activine A en CHIR99021 gedurende drie dagen toegevoegd om stamcellen te induceren om endodermcellen te vormen. In fase twee differentieerden de endodermcellen zich in leverfingsfogenen nadat ze gedurende vijf dagen met een differentiatiemedium waren behandeld. In fase drie, na 10 dagen, waren vroege hepatocyten gerijpt en gedifferentieerd in hepatocytenachtige cellen in hepatocytgroeifactor en oncostatine.

In de laatste fase van differentiatie vertoonden cellen een typisch hepatocytfenotype. RT-PCR, immunofluorescentiekleuring en westelijke blotting werden gebruikt om markers van endodermcellen, leverprecursorcellen en volwassen hepatocyten te detecteren. De gedifferentieerde cellen vertoonden hoge expressieniveaus van differentiatiegerelateerde genen en eiwitten in elke fase, zoals endodermmarkers SOX17 op dag drie, leverprecursormarker HNF4-alfa op dag acht, AFP op dag 14 en volwassen hepatocytmarker ALB op dag 18.

De HLC's vertoonden groene kleuring en uitgebreide cytoplasmatische zuurverschuivingskleuring. De hepatocyten vertoonden typische bi-nucleated morfologie. De enzymatische activiteit van CYP3A4, de essentiële metabolische CYP in de lever in HCC's, werd bevestigd met een enzymtest.

Plaatsing van menselijke embryonale stamcellen met een geschikte dichtheid en begindifferentiatie op de volgende datum zijn van cruciaal belang. Raak in fase één de media voorzichtig aan omdat de cellen gevoelig zijn om omhoog te zweven. De combinatie van activine A en andere kleine moleculen kan de differentiatie-efficiëntie verder verbeteren en in deze procedure meer volwassen hepatocytenachtige cellen produceren.

Deze techniek kan een platform bieden om hepatocyttransplantatie, leverweefseltechnologie, bioartificiële levers en ziektemodellering te verkennen.