Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de kwantificering van fluorescerend gelabelde macropinosomen

Macropinocytose is een endocytische route die belangrijk is voor een verscheidenheid aan cellulaire processen, waaronder het metabolisme van kanker. Met dit protocol kunt u de mate van macropinocytose in cellen in vitro kwantificeren. De automatisering is gericht op het maximaliseren van reproduceerbaarheid, productiviteit en het verminderen van experimentele variatie.

Bovendien kunt u met de fluorescerende microscopie het monster visueel inspecteren om de experimentele kwaliteit te bepalen en aanvullende macropsinosome kenmerken te beoordelen. Cheska Marie Galapate, een onderzoeksassistente van mijn laboratorium, demonstreert samen met mij de procedure. Gebruik voor de 24-putplaat met coverslip-formaat een tang om een enkele coverslip van het ethanolbad vast te pakken.

Tik de coverslip op de binnenwand van de plaat om overtollige ethanol te verwijderen en plaats de coverslip plat op de bodem van de put. Nadat de ethanol is verdampt, wast u de coverslip tweemaal met DPBS en zaait u de cellen bovenop de coverslip door 500 microliter van de celsuspensie aan elke put toe te voegen. Plaats de cellen in een celincubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide totdat de celconfluentie 60 tot 80% bereikt op de dag vóór macropinosoometikettering.

Vervang de dag voor macropinosoometikettering de media in de putten door 500 microliter voorverwarmde serumvrije media en plaats de cellen gedurende 16 tot 24 uur in de incubator. Voor het 96-well microplate-formaat, begin met het overbrengen van de celsuspensie naar een reagensreservoir van 25 milliliter. Vervolgens zaait u met behulp van een meerkanaalspipet 100 microliter van de celsuspensie naar elke put van een zwarte 96-well high-content screening microplaat met een optisch heldere cyclische olefine of glazen bodem.

Incubateer de cellen totdat de celconfluentie 60 tot 80% bereikt op de dag vóór macropinosoometikettering. Verwijder de dag voor de macropinosoometikettering de media uit elke put en gooi deze weg met behulp van een meerkanaals aspiratieadapter voor standaardtips die aan een vacuümpomp zijn bevestigd. Als alternatief kan een meerkanaalspipet worden gebruikt.

Voeg met behulp van een reagensreservoir en een meerkanaalsprechter voorzichtig 100 microliter voorverwarmde serumvrije media toe aan elke put en plaats de cellen vervolgens gedurende 16 tot 24 uur in de celincubator. Vervang voor de 24-well plaat met coverslip-formaat de media in de putjes door 200 microliter serumvrije media met fluorofoor-gelabeld dextran met hoog molecuulgewicht en plaats de cellen gedurende 30 minuten in de celincubator. Na de incubatie, zuig de media op en was de cellen voorzichtig maar snel vijf keer met ijskoude PBS met behulp van een voorgekoelde wasfles.

Schud de plaat stevig met de hand tijdens het wassen om te helpen bij het ontwrichten van dextran-aggregaten die vast komen te zitten aan de coverslips. Fixeer vervolgens de cellen door 350 microliter 3,7% formaldehyde toe te voegen en gedurende 20 minuten te broeden, vervolgens de fixatieoplossing op te zuigen en de cellen tweemaal met PBS te wassen. Kleur de kernen met 350 microliter DAPI in PBS.

Na 20 minuten aspiraleer je de DAPI-oplossing en was je de cellen drie keer met PBS. Hecht siliconen isolatoren naast elkaar op een microscoopglaasje om een gelijkmatige afstand en reproduceerbare lokalisatie van de coverslips te verkrijgen die nodig zijn voor beeldautomatisering. Voeg vervolgens voor elke coverslip een druppel verhardende fluorescentiemontagemedia toe aan de microscoopglaasjes in de open ruimte van de isolator.

Pak een coverslip op met een tang en verwijder overtollige PBS door voorzichtig op de zijkant van de coverslips te tikken op een pluisvrij doekje. Plaats vervolgens de coverslip ondersteboven op de druppel van het montagemedium en tik zachtjes op de coverslip met een gesloten tang om bubbels van de montagemedia te verwijderen. Bewaar de dia's in een donkere omgeving en laat de montagemedia drogen bij kamertemperatuur, meestal 16 tot 24 uur.

Verwijder voor het afbeelden de isolatoren uit het microscoopglaasje. Nadat de dia's op kamertemperatuur zijn gebracht, reinigt u de dekens met een applicator met katoenen punt, bevochtigd met ammoniakvrije glasreiniger. Gebruik vervolgens een schone applicator met katoenen punt bevochtigd met 70% ethanol om de hoeslip schoon te maken en droog te laten.

Voor het 96-well microplate-formaat, na het aanzuigen van de putten zoals eerder aangetoond, voeg 40 microliter serumvrije media met fluorofoor-gelabelde dextran met hoog molecuulgewicht toe aan de putten en incubeer vervolgens de cellen in de celincubator gedurende 30 minuten. Gooi na incubatie de media in de microplaat weg door de plaat handmatig ondersteboven in een leeg bekerglas van vijf liter te vegen, spoel vervolgens de cellen en de microplaat twee keer door de plaat langzaam verticaal onder een lichte hoek onder te dompelen in een bekerglas van twee liter gevuld met ijskoude PBS en vervolgens de PBS in de microplaat weg te gooien door de plaat ondersteboven in het bekerglas van vijf liter te vegen. Na de laatste PBS-spoeling fixeert u de cellen door 100 microliter 3,7% formaldehyde in PBS aan elke put toe te voegen met behulp van een reagensreservoir van 25 milliliter en een meerkanaalspipet.

Verwijder na een incubatietijd van 20 minuten bij kamertemperatuur de fixatieoplossing en was de cellen met PBS met behulp van de onderdompelings- en flikkertechniek. Na de tweede PBS-wassing bevlekt u de kernen met 100 microliter DAPI in PBS per putje. Spoel de cellen na 20 minuten driemaal met ijskoude PBS zoals eerder aangetoond.

Verwijder eventuele resterende PBS door de microplaat ondersteboven op een pluisvrij doekje te tikken. Voeg vervolgens 100 microliter verse PBS toe aan elke put met behulp van een reagensreservoir van 25 milliliter en een meerkanaalspipet. Laat de plaat voor het afbeelden op kamertemperatuur balanceren en veeg vervolgens de celkweekplaat droog met een pluisvrij doekje.

U kunt de plaat ook maximaal een week lang uit de buurt van licht bewaren bij vier graden Celsius. Voor geautomatiseerde macropinosoombeeldvorming maakt u een automatiseringsprotocol om de beelden te verkrijgen met een 40X luchtobjectief in het golflengtekanaal van de dextran fluorofoor en DAPI. Optimaliseer vervolgens de blootstellingsinstellingen met behulp van een monster waarvan wordt voorspeld dat het het hoogste niveau van macropinocytose heeft om overbelichting te voorkomen, wat kan leiden tot verzadiging van het signaal en verlies van intensiteitsgegevens.

Gebruik focusinstellingen die het voorbeeld gemakkelijk en consistent lokaliseren om afbeeldingen van hoge kwaliteit te produceren. Verkrijg meerdere afbeeldingen in elke put of coverslip om rekening te houden met de variabiliteit van het monster en een nauwkeurige weergave van het monster te verkrijgen. Om de macropinocytische index te bepalen, trekt u de achtergrond voor de DAPI en de bijbehorende dextran-afbeelding af door de juiste functie toe te passen, vaak de rolling ball-functie genoemd.

Pas de instellingen aan zodat de achtergrondruis wordt geminimaliseerd met een minimaal tot geen aftrekkingseffect op het DAPI- en dextran-signaal. Bepaal vervolgens met behulp van een veld met een hoog dextran-signaal de intensiteitssignaalinstellingen, vaak de drempelfunctie genoemd, om de kernen te selecteren en bepaal vervolgens de minimale intensiteitssignaalinstelling die nodig is om alleen de macropinosomen te selecteren. Bereken voor het dextranbeeld de totale fluorescentie binnen de gecreëerde macropinosomeselectie of gebruik de selectie om het totale gebied positief voor dextran te bepalen.

Gebruik voor de DAPI-afbeelding de selectie om het aantal kernen in de afbeelding te bepalen om het aantal aanwezige cellen weer te geven. Bepaal vervolgens de macropinocytische index door de totale dextranfluorescentie of -oppervlakte te delen door het aantal cellen dat wordt bepaald door DAPI. In AsPC-1 PDAK-cellen activeert het toevoegen van EGF met 100 nanogram per milliliter gedurende vijf minuten voordat het dextran wordt toegevoegd macropinocytose.

Bovendien kan autocriene EGF-activering van macropinocytose worden geïnduceerd door glutaminedeprivatie gedurende 16 tot 24 uur. MIA PaCa-2 cellen vertonen constitutieve macropinocytose die wordt geremd door een behandeling van 30 minuten met 75 micromolaire EIPA of een twee uur durende behandeling met 10 micromolaire EHop-016. In een dosisresponsexperiment nam de macropinocytische index geleidelijk af bij hogere geneesmiddelconcentraties van EHop-016 en EIPA, waardoor het bestaan van constitutieve Rac1-afhankelijke macropinocytose werd bevestigd.

U kunt deze procedure aanpassen om macropinocytose van andere fluorescerend getagde lading zoals albumine te beoordelen. Bovendien wordt aanbevolen om te evalueren of macropinocytische opname van albumine bijdraagt aan de celfitness door cel levensvatbaarheidstests uit te voeren. Deze techniek heeft centraal gestaan bij de identificatie van macropinocytische nutriëntenvoorziening in kanker- en stromale cellen en de automatisering heeft onze conditietestcapaciteit aanzienlijk vergroot.