Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Het meeste onderzoek met liposomen vertrouwen op gewaagde technieken intrinsiek veronderstellend alle liposomen om identiek te zijn. Door het bestuderen van enkele liposomen, significante inhomogeniteiten kunnen worden waargenomen. De enkele liposoom techniek die hier wordt gepresenteerd stelt ons in staat om honderden liposomen tegelijkertijd te bestuderen en inhomogeniteiten in hun grootte en samenstelling te detecteren.

De methode kan eenvoudig worden aangepast om andere systemen te bestuderen op een enkel liposoom niveau, zoals eiwitmembraan interacties. Alles wat je nodig hebt is de verbinding die u bestudeert te fluorescerend worden gelabeld. Met deze video bieden we onderzoekers de tool over hoe ze enkele liposoomstudies kunnen uitvoeren.

We hopen dat het duidelijk is dat de test gemakkelijk kan worden aangepast om een reeks andere wetenschappelijke onderwerpen te bestuderen. Om te beginnen, meng de bereide lipide voorraden 138 microliters van POPC en 120 microliter cholesterol in een vers glas flacon. Voeg vervolgens 500 microliter toe elk van twee fluorescerende lipiden en 50 microliter van DSPE-PEG-biotine.

Maak het deksel van de glazen flacon los en vries de flacon één tot twee minuten in vloeibare stikstof. Lyophilize de bevroren lipide mengsel 's nachts in een vriesdroger. Voeg 's ochtends een milliliter van 200 millimolar D-sorbitol buffer toe aan de droge lipiden.

Verwarm het mengsel tot 45 graden Celsius en stel het gedurende ten minste een uur bloot aan magnetisch roeren. Bevries vervolgens de lipidessuspensie door de flacon in vloeibare stikstof te dompelen en wacht tot de suspensie volledig bevroren is. Vervolgens dompel de bevroren suspensie in een verwarmingsbad op 55 graden Celsius totdat het mengsel volledig ontdooid is.

Stel het mengsel bloot aan een totaal van 11 vries-dooi cycli. Daarna, met behulp van een mini extrusie kit, extruderen de liposoom suspensie een keer door middel van een 800 nanometer polycarbonaat filter. Meng 1, 200 microliter BSA en 120 microliter BSA biotine.

Voeg 300 microliter van het mengsel toe aan elke put in een acht-put dia en broed de glijbaan gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Lichtjes kantelen van de dia en vanaf de rand van elke goed aspirate het medium. Voeg onmiddellijk 300 microliters hepes buffer in elke put te wassen.

Was elke put acht keer in totaal. Voeg 250 microliter streptavidin toe en broed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de acht wasbeurten zoals eerder beschreven.

Plaats de dia op de microscoop en pas de microscoop joystick aan om zich te concentreren op het oppervlak van de kamer. Dit kan gemakkelijk worden gedaan met behulp van de verhoogde laser reflectie signaal van de glazen buffer interface als een gids. Voeg in een microcentrifugebuis 10 microliter van de verdunde liposoomvoorraad toe met 20 micromolar totale lipiden.

Breng 100 microliter buffer van de kamer naar de microcentrifuge buis, meng goed, en breng de 110 microliters terug in de kamer. Leg de kamer onder de microscoop en gebruik een rudimental microscoop instelling die in staat is het detecteren van signaal van de liposoom fluorofoof om de liposomen worden geïmmobiliseerd op het oppervlak te observeren. Stel de microscoop zoals beschreven in het manuscript.

Om zowel de DOPE ATTO488 als DOPE ATTO655 fluoroforen in de liposomen in beeld te brengen, beeld je meerdere kanalen. Zorg ervoor dat elk kanaal opeenvolgend wordt afgebeeld om kruisexcitatie te voorkomen. Neem bijvoorbeeld eerst een beeld door op tewinden op 488 nanometer en de emissie van 495 tot 590 nanometer te lezen.

Daarna, verander de instellingen en neem een ander beeld door spannend op 633 nanometer, maar het lezen van de uitstoot alleen op 660 tot 710 nanometer. Analyseren. Kies in het afbeeldingsmenu kleur en gebruik de merge-kanaalfunctie om een compositie van de twee kanalen te maken. Let op of de liposomen die in twee verschillende kanalen zijn afgebeeld, een goede colokalisatie weergeven of dat er zichtbare drift is opgetreden.

Als u deeltjes wilt detecteren, opent u het menu Plug-ins, kiest u ComDet en klikt u op deeltjes detecteren. Controleer in ComDet of de instellingen correct zijn en druk op OK. Na het uitvoeren van de analyse worden twee pop-upvensters met resultaten en samenvatting weergegeven. De resultatentabel bevat de intensiteitsverhouding tussen de twee kanalen.

Exporteer de gegevenstabelresultaten met de colokalisatiegegevens. Pas de intensiteitsverhouding histogram met een Gaussische functie en extraheer de gemiddelde en standaarddeviatie. De gemiddelde en standaarddeviatie kunnen worden gebruikt om de mate van inhomogeniteit te berekenen.

Bereid een liposoom formulering die meerdere malen is geëxtrudeerd door middel van een 50 nanometer filter. Kalibreer de grootte van de liposomen door de fluorescentieintensiteit te vergelijken met groottegegevens van DLS. Met dezelfde experimentele microscoop instellingen als voorheen, beeld de kalibratie liposomen.

Plot een vierkant wortel intensiteit histogram van de fluorescentie intensiteit van de kalibratie liposomen. Pas het histogram met een log normale verdeling en extraheren de gemiddelde fluorescentie intensiteit van de kalibratie liposomen als het geometrische gemiddelde. Om de relatie tussen de vierkante wortelintensiteit en de lipossome grootte te bepalen, bereken de correctiefactor door de gemiddelde liposoomdiameter te delen die wordt verkregen uit de dynamische lichtverstrooiingsmetingen met het geometrische gemiddelde van de vierkante wortelintensiteit.

Bereken de waarden van de vierkante wortelintensiteit voor de liposomen in het compositorische inhomogeniteitsexperiment en converteer deze twee diameters door te vermenigvuldigen met de correctiefactor. Plot de intensiteitsverhouding waarde als een functie van diameter voor de compositorische inhomogeniteit liposomen, waardoor het bereiken van de inhomogeniteit als een functie van lipossome grootte voor een populatie van liposomen verspreid van ongeveer 50 nanometer tot 800 nanometer. In dit protocol werd de succesvolle oppervlakteimmobilisatie van liposomen onmiddellijk duidelijk bij de toevoeging van de liposoomoplossing aan de kamer die wordt aangegeven door de diffractie met beperkte intensiteit.

Het wordt aanbevolen om genoeg liposomen te immobiliseren om een dichtheid van 300 tot 400 liposomen per frame te bereiken. Een lagere dichtheid maakt de data-analyse tijdrovender, terwijl een hogere dichtheid het een uitdaging maakt om enkele liposomen te onderscheiden. Als het hele gezichtsveld niet in de juiste focus staat, kan de monsterplaat kantelen.

Ook, als de liposomen lijken groot en wazig, dit geeft aan dat de buffer in de kamer zou kunnen zijn verdampt en het oppervlak uitgedroogd. De intensiteit verhouding histogrammen meestal onthullen een Gaussische verdeling rond een gemiddelde verhouding waarde. Als sterke afwijkingen van een Gaussische verdeling worden waargenomen, duidt dit op een detectiegevoeligheidsprobleem dat suggereert dat een subset van liposomen met een zwakker signaal is uitgesloten.

Na het aanbrengen van de intensiteitsverhouding histogram met een Gaussische functie, werd een graad van inhomogeniteitswaarde van 0,23 vertaald naar 32% van de bevolking die met meer dan 23% verschilde van de gemiddelde kiesverhouding van het ensemble. De kwantificering van de experimentele onzekerheid bleek 0,1 te zijn. De test zal nooit beter dan de materialen die u gebruikt, zodat hoge kwaliteit unilaminar liposomen zijn essentieel.

Dus als je deze voor te bereiden, niet knippen geen hoeken, zoals het weglaten van vries-dooi cycli. Slechte beelden zullen leiden tot hoge experimentele onzekerheid en maak je overschatten de inhomogeniteit dus neem de tijd om goede in-focus beelden te verwerven. Wat de test in principe doen is het bestuderen van de oppervlaktedichtheid van het fluorescerende label.

Als dit fluorescerende label is op een percolated lipide, dan is deze test kan worden gebruikt om de kwaliteit test liposomen voor de levering van geneesmiddelen. De setup is toegepast om te bestuderen hoe peptiden binden aan membranen en de kromming voelen. Dit heeft onderzoekers unieke inzichten gegeven aan de moleculaire signalen die bepalen hoe peptiden worden gesorteerd in cellen.