Name: Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer hoe u cellulaire bio-energetica beoordeelt in hematopoietische stamcellen van muizen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Deze methode meet ECAR en OCR in realtime voor inzicht in metabole functies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in lombard laboratorium wordt ondersteund door de NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 en ME200030) en Glenn Foundation for Medical Research. Het werk in het Li-laboratorium wordt ondersteund door NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Alle dierproeven met gewervelde dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van het University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.
1. Dag voor de test (Totale tijd: ~ 10 min)
<ol><li>Hydratatie van de sensorcartridge (staptijd: ~ 10 min)<ol>
<li>Open de extracellulaire fluxtestkit en verwijder de sensorcartridge en de gebruiksplaat. Sla laadgidsen op voor gebruik de volgende dag.</li>
		<li>Scheid de sensorcartridge (het bovenste groene deel met deksel) handmatig van de gebruiksplaat (onderste 96-well microplaat) en plaats deze ondersteboven naast de utility-plaat.</li>
		<li>Vul met behulp van een meerkanaalspipet elke put van de nutsplaat met 200 μL kalibrant, meegeleverd met fluxtestkit.</li>
		<li>Plaats de sensorcartridge terug op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat u de sensoren volledig onderdompelt in het kalibrant.</li>
		<li>Plaats de geassembleerde sensorcartridge en de gebruiksplaat met kalibrant een nacht in een niet-CO2 incubator van 37 °C. Om verdamping van het kalibrant te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de incubator goed wordt bevochtigd. Als u een gewone ovenincubator gebruikt voor incubaties zonder CO2 37 °C, plaatst u een open bekerglas met water in de incubator om het te bevochtigen. Gebruik, indien beschikbaar, een XF-voorbereidingsstation voor alle incubaties van niet-CO2 37 °C. OPMERKING: Als alternatief kan de sensorcartridge 's nachts worden gehydrateerd met 200 μL per put steriel ultrapuur water in een niet-CO2 37 °C incubator. Vervang water door 200 μL per put van 37 °C voorverwarmd kalibrant, ten minste 45-60 minuten voordat u de injectiepoorten op de dag van de test laadt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dag van de test (Totale tijd: ~ 9 h 30 min)
OPMERKING: De hierboven aangegeven totale tijd omvat de cumulatieve duur van stap 2.1-2.4 naast stap 2.5 of stap 2.6.
<ol><li>Voorbereiding van celklevende microplaten (staptijd: ~ 1 h 30 min) OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast.<ol>
<li>Bereid 2,5 ml van de cellijmoplossing (22,4 μg/ml, zie de materialentabel) per 96-well celkweekmicroplaat door 56 μg van de cellijm op te lossen in een geschikt volume filtergesteriliseerd 0,1 M natriumbicarbonaat (pH 8,0) en onmiddellijk 1 N natriumhydroxide toe te voegen aan de helft van het volume cellijm. Vortex of pipet op en neer om te mengen.</li>
		<li>Open de 96-well celkweekmicroplaat (meegeleverd met de flux assay kit) en doseer 25 μL van de bereide celkleefoplossing op de bodem van elke put. Bedek de microplaat met het deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de kap.</li>
		<li>Verwijder na incubatie overtollige cellijmoplossing en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet of aspirator en was elke put tweemaal met 200 μL steriel ultrapuur water. Droog de plaat aan de lucht, met het deksel verwijderd, in de kap gedurende 30-45 minuten. OPMERKING: Microplaten met celkleefstofcoating mogen maximaal één week bij 4 °C worden bewaard. Voorgecoate microplaten die bij 4 °C zijn opgeslagen, moeten vóór het zaaien van cellen tot kamertemperatuur in de kap worden verwarmd.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van testmedia (staptijd: ~ 30 min)<ol>
<li>Bereiding van glycolyse stress test medium<ol>
<li>Vul 100 ml basismedium aan (zie de tabel met materialen) met 1 ml L-glutamine van 200 mM. OPMERKING: De uiteindelijke L-glutamineconcentratie in het testmedium is 2 mM.</li>
			<li>Verwarm het met L-glutamine aangevulde medium tot 37 °C in een waterbad.</li>
			<li>Stel de pH van het warme medium in op 7,4 met 1 N NaOH.</li>
			<li>Filter-steriliseer het medium met een filter van 0,2 μm en houd het op 37 °C totdat het klaar is voor gebruik.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiding van mitochondriaal stresstesttestmedium<ol>
<li>Supplement 100 ml van het basismedium met 0,45 g glucose, 1 ml L-glutamine van 200 ml en 1 ml natriumpyruvaat van 100 mM. OPMERKING: Het uiteindelijke testmedium bevat 25 mM glucose, 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat.</li>
			<li>Warme glucose, L-glutamine en het natriumpyruvaat-aangevuld medium tot 37 °C in een waterbad.</li>
			<li>Stel de pH van het warme medium in op 7,4 met 1 N NaOH.</li>
			<li>Filter-steriliseer medium met een filter van 0,2 μm en houd op 37 °C totdat het klaar is voor gebruik.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Oogst muislijnnegatieve HSPC's (staptijd: ~ 3 h)<ol>
<li>Bereid de testbuffer door de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank aan te vullen met 4% foetaal runderserum. Bereid 1x verrijkingsbuffer door de 5x bouillon te verdunnen met steriel gedestilleerd water. Houd beide buffers op ijs tot gebruik.</li>
		<li>Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie en verwijder de achterpoten met een schaar. Verwijder voorzichtig alle weefsels van de botten en knip de uiteinden aan beide zijden van het dijbeen en scheenbeen met een schaar. Spoel beenmergcellen uit het dijbeen en scheenbeen met behulp van de testbuffer. Leid de gespoelde cellen door een steriel filter van 70 μm, centrifugeer het filtraat gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 × g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Lyseer de rode bloedcellen door de celkorrel opnieuw op te suspenderen in 500 μL ACK-buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Na lysis gedurende 1 minuut op ijs, was de monsters door toevoeging van 1 ml testbuffer en centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Incubeer de monsters na het wassen met een cocktail van gebiotinyleerde antilichamen gericht tegen CD2 (1:200 verdunning), CD3 (1:200 verdunning), CD5 (1:200 verdunning), CD8 (1:200 verdunning), Ter-119 (1:200 verdunning), B220 (1:200 verdunning) en Gr-1 (1:800 verdunning) gedurende 45 minuten op ijs in een totaal volume van 500 μL testbuffer.</li>
		<li>Was de monsters met 1 ml testbuffer met centrifugatie zoals hierboven.</li>
		<li>Was de monsters met 1 ml 1x verrijkingsbuffer met centrifugatie zoals hierboven.</li>
		<li>Incubeer de monsters met 20 μL streptavidin nanokorrels en 100 μL 1x verrijkingsbuffer op ijs gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Was de monsters met 1 ml 1x verrijkingsbuffer met centrifugatie zoals hierboven.</li>
		<li>Resuspend de monsters in 2,5 ml 1x verrijkingsbuffer. Plaats ze gedurende 5 minuten op een scheidingsmagneet. Verzamel de supernatanten afzonderlijk in conische buizen van 15 ml.</li>
		<li>Resuspend magneetgescheiden monsters in een extra 2,5 ml 1x verrijkingsbuffer en plaats ze opnieuw op de scheidingsmagneet gedurende 5 minuten. Verzamel en combineer supernatanten van de eerdere collecties in conische buizen van 15 ml uit stap 2.3.9. OPMERKING: De supernatanten bevatten de afstammingsnegatieve celfracties.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buizen van 15 ml die de negatief geselecteerde cellen bevatten gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.</li>
		<li>Resuspend de celkorrels in 1 ml testbuffer en tel het celnummer met trypan blue handmatig of via een geautomatiseerde celteller zoals een Gravin 3. OPMERKING: Volgens de hierboven beschreven benadering moeten ~ 6 × 106 afstammingsnegatieve HSPC's gemakkelijk worden gezuiverd uit de achterpoten van een enkele muis. Als reagentia, zoals assaybuffer, 1x verrijkingsbuffer en afstammingsspecifieke antilichaamcocktail, worden bereid op de dag voorafgaand aan het experiment, duurt het ongeveer 2,5-3 uur om HSPC's van 4 muizen te verrijken. Het zou nog eens 10 minuten duren voor elke muis voorbij dit aantal.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaaicellen in microplaten met cellijmcoating (staptijd: ~ 1 uur)<ol>
<li>Centrifugeer cellen uit stap 2.3.12 bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in het juiste testmedium (glycolysestresstestmedium of mitochondriaal stresstestmedium). Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Herhaal stap 2.4.2. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in het geschikte verwarmde testmedium tot een concentratie van 2,5 × 105 cellen per 50 μL of 5 × 106 per ml.</li>
		<li>Pipetteer 50 μL van de celsuspensie langs de zijkant van elke put van de kamertemperatuur cel-met kleefstof gecoate 96-well celkweek microplaat. Pipetteer 50 μL van het testmedium in de hoekachtergrondmeetputten. Gebruik een meerkanaalspipet voor celbeplating om consistentie te garanderen.</li>
		<li>Maak een centrifugebalansplaat door 50 μL water per put van een niet-gecoate 96-well celkweekmicroplaat toe te voegen.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen in de plaat bij 200 × g gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Rem niet. Breng de plaat gedurende 25-30 minuten over naar een niet-CO 2 incubator van 37 °C om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn bevestigd. Bevestig visueel onder een microscoop dat de cellen stabiel aan het microplaatoppervlak zijn gehecht. OPMERKING: Aangezien ~ 6 × 106 afstammingsnegatieve HSPC's kunnen worden geoogst uit de achterpoten van een enkele muis, zijn HSPC's geïsoleerd uit 4 muizen (~ 2,4 × 107 cellen) nodig om een volledige 96-well plaat te vullen als het doel is om meerdere interventies ex vivo parallel te screenen. Als het doel echter is om de impact van een genetische verandering of een interventie op de metabole parameters van HSPC's in vivo te onderzoeken, dan kunnen HSPC's geïsoleerd uit meerdere paren controle- en testmuizen parallel worden geanalyseerd in meerdere technische replicaties met behulp van een enkele plaat.</li>
	</ol></li>
	<li>Uitvoeren van glycolyse stress test met behulp van de extracellulaire flux analyzer (Stap tijd: ~ 3 h 30 min)<ol><li>Sensorcartridge met injecteerverbindingen laden<ol>
<li>Bereid 100 mM glucose, 20 μM oligomycine en 500 mM 2-DG oplossingen in voorgewarmde glycolyse stress test medium (pH 7,4). OPMERKING: Alle injecterende samengestelde oplossingen worden gemaakt met een concentratie van 10x. De uiteindelijke putconcentraties zijn 10 mM voor glucose, 2 μM voor oligomycine en 50 mM voor 2-DG (zie tabel 1).</li>
			<li>Verwijder de gehydrateerde sensorcartridge uit de niet-CO2 incubator van 37 °C uit stap 1.1.5. Verwijder luchtbellen uit het kalibrant in de gebruiksplaat door de sensorcartridge uit het kalibrant te tillen en op dezelfde gebruiksplaat te vervangen door de kalibrant.</li>
			<li>Plaats de A/D-laadgeleider plat (meegeleverd in de extracellulaire fluxtestkit) op de bovenkant van de sensorcartridge en oriënteer deze zo dat de letter 'A' zich in de linkerbovenhoek bevindt om ervoor te zorgen dat alleen poort A beschikbaar is om te laden. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 20 μL 100 mM glucose-oplossing in poort A.</li>
			<li>Vervang de A/D-laadgeleider plat door de B/C-laadgeleider plat, zodat de letter 'B' zich in de linkerbovenhoek bevindt om ervoor te zorgen dat alleen poort B beschikbaar is om te laden. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 22 μL 20 μM oligomycine-oplossing in poort B.</li>
			<li>Heroriënteer de B/C-laadgeleider plat om de letter 'C' in de linkerbovenhoek te vinden voor laadpoorten C. Doseer met behulp van een meerkanaals pipet 25 μL van 500 mM 2-DG-oplossing in poort C.</li>
			<li>Verwijder de laadgeleiderflats en gooi ze weg. OPMERKING: Het is belangrijk dat elke poortreeks van alle 96 putten, inclusief die van de achtergrondputten, volledig wordt geladen met hetzelfde volume van de injecterende verbinding.</li>
		</ol></li>
		<li>Sjablonen maken, kalibreren en meten<ol>
<li>Maak of laad de sjabloon voor de glycolyse-stresstest op de controller. Voer details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd. Wijs de 4 hoekputten toe voor achtergrondmetingen.</li>
			<li>Controleer in het protocol of kalibratie en evenwicht zijn gecontroleerd in de initialisatiestap .</li>
			<li>Voor nulmeting en metingen na elke injectie (glucose, oligomycine en 2-DG), stelt u het aantal meetcycli in op 3 en Mix - Wait - Meettijden op 3 min - 0 min - 3 min (zie tabel 2).</li>
			<li>Verwijder het deksel van de met verbindingen geladen en gehydrateerde sensorcartridge, ondergedompeld in kalibrant in de gebruiksplaat. Plaats het op de werklade van de extracellulaire fluxanalysator en begin met de run. OPMERKING: De eerste stap is de kalibratie, die meestal ~ 20 minuten duurt.</li>
			<li>Haal de microplaat met de cellen uit de niet-CO2 37 °C incubator uit stap 2.4.6 nadat 25-30 minuten incubatie voorbij is. Voeg zonder de cellen te storen langzaam 130 μL van het voorgewarmde glycolyse-stresstesttestmedium (pH 7,4) per put toe om het mediumvolume in elke put op te maken tot 180 μL en breng de plaat terug naar de niet-CO2 37 °C incubator voor extra 15-20 minuten. OPMERKING: Een totale incubatietijd van 45-60 minuten na centrifugeren heeft de voorkeur.</li>
			<li>Nadat de kalibratie is voltooid, vervangt u de gebruiksplaat door de testmicroplaat (zonder deksel) die de cellen bevat. Druk op de loadcelplaat om de metingen te starten, wat ~ 1,5 uur duurt voordat de test is voltooid.</li>
			<li>Nadat de metingen zijn voltooid, verzamelt u de testmicroplaat die de cellen bevat en verwijdert u het testmedium zonder de cellen te storen. Was eenmaal voorzichtig met 250 μL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder de cellen te ontwrichten.</li>
			<li>Voeg 10 μL RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% Na deoxycholaat, 0,1% natriumdodecylssulfaat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), aangevuld met 1x proteaseremmercocktail, toe aan elke put en roer de plaat op een shaker gedurende 10 minuten. Vries de hele plaat in bij -80 °C.</li>
			<li>Ontdooi de plaat en voer een eiwitmeting uit voor gegevensnormalisatie volgens de instructies van de fabrikant.</li>
			<li>Haal de gegevens op en analyseer deze. Open het gegevensbestand met Wave Desktop Software. Klik op Normaliseren en plak de normalisatiewaarden voor elk putje. Klik op toepassen om de gegevens te normaliseren. Klik op Exporteren en selecteer glycolyse stresstestrapportgenerator om de geanalyseerde gegevens naar een rapportgenerator te exporteren. U kunt de gegevens ook exporteren naar een externe toepassing. OPMERKING: Als alternatief kan het totale nucleaire DNA-gehalte in elke put worden gebruikt om de gegevens te normaliseren. Een fluorescerende kleurstof, zoals CyQuant die bindt aan nucleïnezuur, kan worden gebruikt om het totale nucleaire DNA-gehalte per put te beoordelen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Het uitvoeren van een mitochondriale stresstest met behulp van de extracellulaire fluxanalysator (staptijd: ~ 3 h 30 min)<ol>
<li>Sensorcartridge met injecteerverbindingen laden<ol>
<li>Bereid 20 μM oligomycine, 20 μM FCCP en 5 μM rotenon + 5 μM antimycine A-oplossingen in voorgewarmd mitochondriaal stresstesttestmedium (pH 7,4). OPMERKING: Alle injecterende samengestelde oplossingen worden gemaakt met een concentratie van 10x. De uiteindelijke putconcentraties zijn 2 μM voor oligomycine, 2 μM voor FCCP en 0,5 μM voor rotenon en antimycine A (zie tabel 3).</li>
			<li>Verwijder de patroon van de gehydrateerde sensor uit de incubator van 37 °C uit stap 1.1.5 en verwijder luchtbellen zoals eerder beschreven in stap 2.5.1.2.</li>
			<li>Geef volgens de stappen 2.5.1.3 tot en met 2.5.1.6 20 μL 20 μM oligomycine af in poort A, 22 μL 20 μM FCCP in poort B en 25 μL een mengsel van 5 μM rotenon en 5 μM antimycine A in poort C. OPMERKING: Het is belangrijk dat elke poortreeks van alle 96 putten, inclusief die van de achtergrondputten, volledig wordt geladen met hetzelfde volume injecteermiddel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sjablonen maken, kalibreren en meten<ol>
<li>Maak of laad de sjabloon voor de mitochondriale stresstest op de controller. Voer details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd. Wijs de 4 hoekputten toe voor achtergrondmetingen.</li>
			<li>Controleer in het protocol of kalibratie en evenwicht zijn gecontroleerd in de initialisatiestap.</li>
			<li>Voor nulmeting en metingen na elke injectie (oligomycine, FCCP en rotenon + antimycine A), stelt u het aantal meetcycli in op 3 en Mix - Wait - Meettijden op 3 min - 0 min - 3 min (zie tabel 4).</li>
			<li>Start de uitvoering om de kalibratie uit te voeren zoals in stap 2.5.2.4.</li>
			<li>Voeg 130 μL van het voorgewarmde mitochondriale stresstestmedium (pH 7,4) toe per put en in stap 2.5.2.5.</li>
			<li>Start de metingen; de gegevens ophalen en analyseren zoals in de stappen 2.5.2.6 tot en met 2.5.2.10. Exporteer de geanalyseerde gegevens naar de mitochondriale stresstestrapportgenerator of een externe toepassing.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+%28HSPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
<li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li>
<li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells%3A+new+perspectives+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%2C+Fourth+Edition%22">Bioenergetics, Fourth Edition</a>. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).</li>
<li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent%3A+mechanism+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dit method paper beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van cellulaire bio-energetica (glycolyse en OxPHOS) in muis HSPC's met behulp van de Seahorse extracellulaire flux analyzer. Dit apparaat is een krachtig hulpmiddel dat tegelijkertijd de ECAR en OCR van levende cellen meet, die respectievelijk metrieken zijn van glycolyse en mitochondriale ademhaling. Het kan dus worden gebruikt om de cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen. Verder biedt het 96-well microplate-gebaseerde platform kwa...

Hematopoiese is het proces waarbij verschillende soorten volwassen bloedcellen met zeer gespecialiseerde functies worden gevormd uit HSC's1. HSC's zijn in staat tot zelfvernieuwing en differentiatie in verschillende multipotente en afstammingsspecifieke voorloperpopulaties. Deze voorlopers produceren uiteindelijk cellen van lymfoïde, myeloïde, erytroïde en megakaryocytenlijnen. Om hun zelfvernieuwingscapaciteit te behouden, blijven HSC's grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze, net als andere weefselstamcellen, afhankelijk zijn van glycolyse in plaats van mitochondriaal OxPHOS voor ATP-productie 2,3. Toegang tot de celcyclus leidt tot verbeterde ademhaling en OxPHOS, wat resulteert in verhoogde niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die schadelijk zijn voor HSC-onderhoud en -functie3. Herhaalde celdeling kan dus leiden tot een verminderd zelfvernieuwend vermogen van HSC's en uiteindelijk tot uitputting ervan.
Bij volwassen hematopoiese ondergaan HSC's voornamelijk asymmetrische celdeling, waarbij een van de dochtercellen HSC-potentieel behoudt en blijft vertrouwen op glycolytisch metabolisme. De andere dochtercel wordt een primitieve voorlopercel die zelfvernieuwingsvermogen verliest maar zich vermenigvuldigt en uiteindelijk aanleiding geeft tot gedifferentieerde functionele hematopoëtische cellen4. Wanneer HSC's differentiëren om stroomafwaartse voorlopers te produceren, wordt gedacht dat een omschakeling van glycolyse naar mitochondriaal metabolisme plaatsvindt om de energie en bouwstenen te leveren die nodig zijn om deze snelle overgang te ondersteunen5, zoals gesuggereerd door de observaties dat HSC's inactieve mitochondriale massa bezitten 6,7,8,9 . Daarentegen is mitochondriale activiteit (aangegeven door gekoppelde ROS-niveaus) veel hoger in afstammingsgebonden voorlopers dan in HSC's 9,10,11. Metabole veranderingen die optreden tijdens de vroegste stap van hematopoëse suggereren dus een directe en cruciale rol van mitochondriën bij het reguleren van het lot van HSC.
Disfunctionele mitochondriën die aanwezig zijn onder verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas12, kunnen het zelfvernieuwingsvermogen van HSC verstoren, waardoor een onbalans in HSC / voorloperdifferentiatie wordt veroorzaakt door overmatige hoeveelheden ROS te produceren, de ATP-productie te verminderen en / of door andere metabole processen te veranderen 9,12,13 . Verstoringen in metabole homeostase in HSC/voorloper differentiatie kunnen een significante invloed hebben op de hematopoëse, wat mogelijk bijdraagt aan de ontwikkeling van hematologische afwijkingen13. Gezien de kritische invloeden van glycolyse en mitochondriaal OxPHOS op HSC-stengelheid en differentiatie, is het van belang om zowel metabole parameters onder normale als stressomstandigheden te onderzoeken. Waardevolle inzichten in de glycolytische en mitochondriale functie van HSC's en voorlopercellen kunnen worden verkregen door hun ECAR en OCR te beoordelen, die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.
De Seahorse extracellulaire flux analyzer is een krachtig apparaat uitgerust met twee sondes per put om tegelijkertijd ECAR en OCR in levende cellen te meten en kan dus worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen, in reactie op verschillende substraten of remmers. De testcartridge die met de analysator wordt gebruikt, bevat injectiepoorten om maximaal vier geneesmiddelen voor geautomatiseerde injectie tijdens de test te houden. Een schema van een typische glycolyse stresstest is weergegeven in figuur 1A. De test begint met het meten van ECAR van cellen, geïncubeerd in glycolyse stresstestmedium dat glutamine bevat, maar geen glucose of pyruvaat. Dit vertegenwoordigt verzuring die optreedt als gevolg van niet-glycolytische activiteiten van de cellen en wordt gerapporteerd als niet-glycolytische verzuring. Dit wordt gevolgd door de injectie van glucose in een verzadigingsconcentratie. Via glycolyse wordt glucose in de cel omgezet in pyruvaat, dat verder wordt gemetaboliseerd in het cytoplasma om lactaat te produceren, of in mitochondriën om CO2 en water te produceren.
Omzetting van glucose in lactaat veroorzaakt nettoproductie en daaropvolgende afgifte van protonen in het extracellulaire medium, wat resulteert in een snelle toename van de ECAR 14,15,16. Deze glucose-gestimuleerde verandering in ECAR wordt gerapporteerd als glycolyse onder basale omstandigheden. De tweede injectie bestaat uit oligomycine (een remmer van ATP-synthase, ook bekend als complex V17), dat de mitochondriale ATP-productie remt. Tijdens oligomycine-gemedieerde OxPHOS-remming upreguleren cellen de glycolyse maximaal om aan hun energetische eisen te voldoen. Dit veroorzaakt een verdere toename van ECAR, waardoor de maximale glycolytische capaciteit van de cellen wordt onthuld. Het verschil tussen de maximale glycolytische capaciteit en basale glycolyse wordt glycolytische reserve genoemd. Ten slotte wordt 2-DG geïnjecteerd, wat een aanzienlijke daling van de ECAR veroorzaakt, meestal dicht bij niet-glycolytische verzuringsniveaus. 2-DG is een glucose-analoog dat concurrerend bindt aan hexokinase, wat resulteert in remming van glycolyse18. De door 2 DG geïnduceerde afname van ECAR bevestigt dus verder dat glycolyse inderdaad de bron is van ECAR waargenomen na glucose- en oligomycine-injecties.
Figuur 1B toont het schema voor een typische mitochondriale stresstest. De test begint met baseline OCR-meting van de cellen, geïncubeerd in mitochondriaal stresstestmedium dat glucose, glutamine en pyruvaat bevat. Na basale OCR-metingen wordt oligomycine geïnjecteerd in deze test, die complexe V remt, waardoor de elektronenstroom door de elektronentransportketen (ETC)17 wordt verminderd. Bijgevolg wordt OCR verminderd als reactie op oligomycine-injectie en deze afname van OCR is gekoppeld aan mitochondriale ATP-productie. De tweede injectie bestaat uit carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), een protonofoor en een ontkoppelaar van mitochondriaal OxPHOS17. FCCP stort de mitochondriale protongradiënt in door de stroom van protonen over het mitochondriale binnenmembraan mogelijk te maken. Door de FCCP-injectie wordt de elektronenstroom door de ETC onderdrukt en verbruikt complex IV zuurstof op het maximale niveau. Het verschil tussen maximale OCR en basale OCR wordt de reserve ademhalingscapaciteit genoemd, wat een maat is voor het vermogen van de cel om te reageren op een verhoogde energievraag onder stressomstandigheden. Ten slotte wordt een mengsel van twee ETC-remmers (rotenon, een complex I-remmer en antimycine A, een complexeIII-remmer 17) geïnjecteerd, waardoor de elektronenstroom volledig wordt afgesloten en OCR tot een laag niveau afneemt. OCR gemeten na rotenon en antimycine A-injectie komt overeen met niet-mitochondriale OCR aangedreven door andere processen in de cellen. Niet-mitochondriale OCR maakt de berekening van basale ademhaling, protonenlekkage en maximale ademhaling mogelijk.
Basale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen baseline OCR en niet-mitochondriale OCR. Protonlek verwijst naar het verschil tussen OCR na oligomycine-injectie en niet-mitochondriale OCR. Maximale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen OCR na FCCP-injectie en niet-mitochondriale OCR. De koppelingsefficiëntie wordt berekend als het percentage atp-productiesnelheid ten opzichte van de basale ademhalingsfrequentie. Dit method paper biedt een gedetailleerd protocol voor het meten van ECAR en OCR in afstammingsnegatieve HSPC's met behulp van de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van muizenlijnnegatieve HSPC's, verklaart de optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van verschillende geneesmiddelen die worden gebruikt in extracellulaire fluxtests en beschrijft strategieën voor medicamenteuze behandeling.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m filter</td><td>Corning</td><td>430626</td><td>Wordt gebruikt om het assay-medium te filteren en te steriliseren</td></tr><tr><td>100 mM natriumpyruvaat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Component van mitochondriale stress test assay-medium</td></tr><tr><td>15 mL conische Falcon buizen</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>Gebruikt tijdens het oogsten van HSPC's en voor het bereiden van assay-medicijnoplossingen</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Component van glycolyse stress test en mitochondriaal stress test assay-media</td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>3e medicijninjectie tijdens glycolyse stress test</td></tr><tr><td>5x verrijkingsbuffer (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480017</td><td>Gebruikt voor wasbeurten tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-3</td><td>Component van ACK lysis buffer</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>3e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC-eiwitassaykit</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>Gebruikt volgens de instructies van de fabrikant</td></tr><tr><td>Carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>2e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cellulair hechtingsmiddel. Gebruikt voor het coaten van cellulaire microplaten</td></tr><tr><td>Countes 3 geautomatiseerde celteller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td>Component van ACK lysis buffer en RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu;m filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Gebruikt als celstrainer tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Gibco foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>26400044</td><td>Gebruikt om assay-buffer te bereiden tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Gibco HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td>Gebruikt om assay-buffer te bereiden tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Component van mitochondriaal stress test assay-medium en eerste injectie van glycolyse stress test</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>2e medicijninjectie tijdens glycolyse stress test en 1e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Gebruikt om cellen te wassen na assay voor eiwitkwantificering</td></tr><tr><td>Kaliumbicarbonaat (KHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P235-500</td><td>Component van ACK lysis buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (PIC)</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Wordt geleverd als tabletten. Een tablet werd opgelost in 10 mL RIPA-buffer om 1x PIC te maken.</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103203</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108403</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>3e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzer</td><td>Seahorse Biosciences nu Agilent</td><td></td><td>Voor ECAR en OCR metingen in real time.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Gebruikt om Cell-adhesive oplossing voor microplaatcoating te maken</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Component van RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Component van RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>Natriumfluoride (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td>Component van RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Bereid 1 N oplossing. Gebruikt voor pH-normalisatie</td></tr><tr><td>Streptavidine Nanobeads (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480015</td><td>Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>Component van RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>XF basismedium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>basismedium gebruikt om glycolyse stress test en mitochondriaal stress test assay-media te bereiden</td></tr><tr><td>XF voorbereid station</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td>Gebruikt voor niet-CO2 37 &deg;C incubaties</td></tr><tr><td>XFe96 extracellulaire FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100 of 102601-100</td><td>Bevat assaycartridges met gebruiksplaten, laadplateaus voor het laden van geneesmiddelen op de assaycartridge, XF-kalibratieoplossing en XF-celcultuur microplaat</td></tr></tbody></table>

beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Onder steady state blijven hematopoëtische stamcellen (HSC's) grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse om aan hun energetische behoeften te voldoen. Onder stressomstandigheden zoals infectie of bloedverlies worden HSC's echter proliferatief en produceren ze snel stroomafwaartse voorlopercellen, die op hun beurt verder differentiëren en uiteindelijk volwassen bloedcellen produceren. Tijdens dit overgangs- en differentiatieproces verlaten HSC's rust en ondergaan ze snel een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering (OxPHOS). Verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas, kunnen de mitochondriale functie negatief beïnvloeden en kunnen dus de metabole herprogrammering en differentiatie van HSC's en voorlopercellen tijdens hematopoëse veranderen. Waardevolle inzichten in glycolytische en mitochondriale functies van HSC's en voorlopercellen onder normale en stressomstandigheden kunnen worden verkregen door de beoordeling van hun extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR), die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling. 
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om ECAR en OCR te meten in van het beenmerg afgeleide afstammingsnegatieve celpopulaties van muizen, die zowel hematopoëtische stam als primitieve voorlopercellen (HSPC's) omvatten, met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van afstammingsneg-negatieve cellen uit het beenmerg van muizen, verklaart optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van 2-deoxy-D-glucose (2-DG, een glucose-analoog dat glycolyse remt) en verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A) die in deze testen worden gebruikt, en beschrijft behandelingsstrategieën voor geneesmiddelen. Belangrijke parameters van glycolytische flux, zoals glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve, en OxPHOS-parameters, zoals basale ademhaling, maximale ademhaling, protonlek, ATP-productie, reserve ademhalingscapaciteit en koppelingsefficiëntie, kunnen in deze testen worden gemeten. Dit protocol maakt ECAR- en OCR-metingen op niet-adherente HSPC's mogelijk en kan worden gegeneraliseerd om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren.

Met behulp van dit protocol werden het celnummer en de concentraties van verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (gebruikt in de extracellulaire flux-assays) geoptimaliseerd om ECAR en OCR van HSPC's te meten die zijn geïsoleerd van 24 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. Eerst werd de glycolyse-stresstest uitgevoerd om het celgetal en de oligomycineconcentratie te optimaliseren. Een wisselend aantal HSPC's per put variërend van 5 × 104 tot 2,5 × 105 werden gebruikt in deze test. Zoals te z...

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Tijdens hematopoiese ondergaan hematopoëtische stamcellen een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering. Dit protocol kan worden gebruikt om glycolytische en mitochondriale functies van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen van muizen te beoordelen. Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen.Het 96-well microplate-gebaseerde platform biedt kwantificering met hoge doorvoer met hoge gevoeligheid, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere monsters met behulp van een enkele plaat mogelijk is. Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van chemicaliën of genetische manipulaties op het HSC-metabolisme onder verschillende omstandigheden te onderzoeken. Het kan helpen bij het ophelderen van metabole routes die HSC-pluripotentie ondersteunen.Hoewel de huidige studie voornamelijk gericht is op hematopoietische stengels en voorlopercellen van muizen, kunnen het protocol en deze aanpak gemakkelijk worden aangepast om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren. Open een dag voor de test de extracellulaire fluxtestkit om de sensorcartridge en de gebruiksplaatassemblage te verwijderen. Bewaar de laadgeleiderflats voor gebruik de volgende dag.Scheid nu handmatig de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven naast de gebruiksplaat. Vul met behulp van een meerkanaalspipet elke put van de gebruiksplaat met 200 microliter kalibrant die bij de fluxtestkit is geleverd en plaats de sensorcartridge vervolgens terug op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig in het kalibrant worden ondergedompeld. Incubeer vervolgens de gebruiksplaat met kalibrant en geassembleerde sensorpatroon in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius 's nachts na de bevochtigingsomstandigheden die in het manuscript worden genoemd.Bereid op de dag van de test 2,5 milliliter van de cellijmoplossing per 96-well celkweekmicroplaat zoals beschreven in het tekstmanuscript. Open de 96-well celkweekmicroplaat die bij de fluxtestkit is geleverd en doseer 25 microliter van de bereide cellijmoplossing op de bodem van elke put. Bedek de microplaat met het deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de kap.Verwijder na incubatie de overtollige cellijmoplossing en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet of aspirator en was elke put tweemaal met 200 microliter steriel ultrapuur water. Droog de plaat zonder deksel in de kap gedurende 30 tot 45 minuten aan de lucht. Centrifugeer de geprepareerde muizenlijnnegatieve HSPC's bij 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de celkorrel in het juiste testmedium en centrifugeert u de celsuspensie opnieuw. Herhaal deze procedure nog een keer en resuspend de cellen in het juiste verwarmde testmedium tot de concentratie van 250.000 cellen per 50 microliter of vijf miljoen cellen per milliliter. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 microliter van de celsuspensie toe te voegen langs de zijkant van elke put van de met cellijm beklede 96-well celkweekmicroplaat en voeg vervolgens 50 microliter van het testmedium toe aan de hoekachtergrondmeetputten.Maak een centrifugebalansplaat door 50 microliter water toe te voegen per put van een niet-gecoate 96-well celkweekmicroplaat. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 200 maal G. Incubeer de plaat in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 25 tot 30 minuten voor celaanhechting.Bevestig na 30 minuten visueel onder een microscoop dat de cellen stabiel aan het microplaatoppervlak zijn gehecht. Begin met het bereiden van alle vereiste oplossingen in het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium zoals vermeld in het tekstmanuscript en verwijder de gehydrateerde sensorcartridge uit de incubator. Til de sensorcartridge uit het kalibrant en vervang deze op dezelfde gebruiksplaat met de kalibrant om de luchtbellen te verwijderen.Plaats de 80-laadgeleider plat op de bovenkant van de sensorcartridge en oriënteer deze zodat de letter A zich in de linkerbovenhoek bevindt. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 20 microliter 100 millimolaire glucoseoplossing in poort A. Vervang de 80-laadgeleider plat door de BC-laadgeleider plat, waarbij u de letter B in de linkerbovenhoek oriënteert. Doseer 22 microliter van 20 micromolaire oligomycine-oplossing in poort B.Heroriënteer de BC-laadgeleider plat om de letter C in de linkerbovenhoek te lokaliseren voor het laden van poort C en doseer 25 microliter van 500 millimolar 2-deoxy-d-glucoseoplossing in poort C. Verwijder en gooi vervolgens de laadgeleiderflats weg.Maak of laad nu de sjabloon voor de glycolyse-stresstest op de controller. Voer de details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op Groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd.Zorg er in het protocol voor dat kalibratie en evenwicht worden gecontroleerd in de initialisatiestap. Stel voor de nulmeting en metingen na elke injectie het aantal meetcycli in op drie en meng, wacht, meet tijden op drie minuten, nul minuten, drie minuten. Klik op Start Uitvoeren in de software.Verwijder het deksel van de met verbindingen geladen en gehydrateerde sensorcartridge en plaats deze op de werklade van de extracellulaire fluxanalysator. Begin de kalibratierun. Haal de microplaat met de zaadcellen uit de couveuse.Zonder de cellen te storen, voegt u langzaam 130 microliter van het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium per put toe om het gemiddelde volume in elke put tot 180 microliter te maken en breng de plaat nog eens 15 tot 20 minuten terug naar de incubator. Klik op Lade openen in de software om de thermische lade van Seahorse te openen. Nadat de kalibratie is voltooid, vervangt u de gebruiksplaat door deze testmicroplaat met de cellen en drukt u op de loadcelplaat om de metingen te starten.Nadat de metingen zijn voltooid, verwijdert u het testmedium van de plaat zonder de cellen te storen en wast u ze voorzichtig met 250 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder de cellen te ontwrichten. Voeg nu 10 microliter radioimmunoprecipitatie lysisbuffer aangevuld met 1X proteaseremmer cocktail toe aan elke put en roer de plaat gedurende 10 minuten op een shaker. Vries de hele plaat in bij min 80 graden Celsius.Ontdooi de plaat en voer een eiwitmeting uit voor gegevensnormalisatie volgens de instructies van de fabrikant. Haal de gegevens op en analyseer deze door het gegevensbestand te openen met de Wave-desktopsoftware. Klik op Normaliseren, plak de normalisatiewaarden voor elk putje en klik vervolgens op Toepassen om de gegevens te normaliseren.Klik op Exporteren en selecteer glycolyse stresstestrapportgenerator om de geanalyseerde gegevens naar een rapportgenerator te exporteren. De niet-glycolytische verzuring stijgt met een verhoogd celgetal van 50.000 tot 250.000, maar neemt slechts minimaal toe tussen 200.000 en 250.000. Injectie van 10 millimolaire glucose stimuleert glycolyse bij alle celaantallen met een maximale toename van ECAR waargenomen bij 250.000 cellen per put.Injectie van twee micromolair oligomycine verhoogt de ECAR echter niet verder. De OCR-gegevens verkregen in dezelfde reeks glycolyse-stresstests tonen een significante daling na oligomycine-injectie als gevolg van complex 5-remming. Glycolyse stress testparameters werden berekend en 250.000 cellen per put in twee micromolaire oligomycine werden geselecteerd voor verdere studies.De mitochondriale stresstest toonde aan dat twee micromolaire oligomycine-injectie een significante vermindering van OCR veroorzaakt via de remming van complex 5. FCCP stimuleert OCR in HSPC's op een dosisafhankelijke manier met een maximale toename waargenomen bij twee micromolair. Een mengsel van 0,5 micromolair rotenon en 0,5 micromolair antimycine A-injectie verlaagt OCR tot het minimale niveau dat overeenkomt met het niet-mitochondriale zuurstofverbruik.Mitochondriale stresstestparameters werden berekend en twee micromolaire FCCP werd geselecteerd voor verdere studies. Gezien de hoge doorvoer van deze techniek, kan het hier beschreven protocol gemakkelijk worden aangepast om een groot aantal bio-energetische modulatoren in hematopoëtische stamcellen, hematopoëtische voorlopers en kwaadaardige hematopoëtische cellen te screenen. Zeepaardjesanalyse wordt veel gebruikt in de literatuur om het metabolisme in een breed scala van contexten te meten in de aanwezigheid van verschillende substraten en remmers.

assessment-cellular-bioenergetics-mouse-hematopoietic-stem-primitive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

This video demonstrates the method to analyze energy metabolism in activated human NK cells using an extracellular flux analyzer. Different inhibitors of the electron transport chain complexes impact ATP synthesis, which is measured through the oxygen consumption rate or OCR, providing insights into cellular metabolism and bioenergetics.

Real-Time Monitoring of Energy Metabolism in Human NK Cells Using an Extracellular Flux Analyzer

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en analyse van hun metabolische staat. Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen zou kunnen bijdragen tot het beter karakteriseren de vraag van primaire cellen en omhoog zou kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde geneeskunde.

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Leer hoe u cellulaire bio-energetica beoordeelt in hematopoietische stamcellen van muizen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Deze methode meet ECAR en OCR in realtime voor inzicht in metabole functies.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Meer video's verkennen