Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Tijdens hematopoiese ondergaan hematopoëtische stamcellen een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering. Dit protocol kan worden gebruikt om glycolytische en mitochondriale functies van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen van muizen te beoordelen. Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen.

Het 96-well microplate-gebaseerde platform biedt kwantificering met hoge doorvoer met hoge gevoeligheid, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere monsters met behulp van een enkele plaat mogelijk is. Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van chemicaliën of genetische manipulaties op het HSC-metabolisme onder verschillende omstandigheden te onderzoeken. Het kan helpen bij het ophelderen van metabole routes die HSC-pluripotentie ondersteunen.

Hoewel de huidige studie voornamelijk gericht is op hematopoietische stengels en voorlopercellen van muizen, kunnen het protocol en deze aanpak gemakkelijk worden aangepast om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren. Open een dag voor de test de extracellulaire fluxtestkit om de sensorcartridge en de gebruiksplaatassemblage te verwijderen. Bewaar de laadgeleiderflats voor gebruik de volgende dag.

Scheid nu handmatig de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven naast de gebruiksplaat. Vul met behulp van een meerkanaalspipet elke put van de gebruiksplaat met 200 microliter kalibrant die bij de fluxtestkit is geleverd en plaats de sensorcartridge vervolgens terug op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig in het kalibrant worden ondergedompeld. Incubeer vervolgens de gebruiksplaat met kalibrant en geassembleerde sensorpatroon in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius 's nachts na de bevochtigingsomstandigheden die in het manuscript worden genoemd.

Bereid op de dag van de test 2,5 milliliter van de cellijmoplossing per 96-well celkweekmicroplaat zoals beschreven in het tekstmanuscript. Open de 96-well celkweekmicroplaat die bij de fluxtestkit is geleverd en doseer 25 microliter van de bereide cellijmoplossing op de bodem van elke put. Bedek de microplaat met het deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de kap.

Verwijder na incubatie de overtollige cellijmoplossing en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet of aspirator en was elke put tweemaal met 200 microliter steriel ultrapuur water. Droog de plaat zonder deksel in de kap gedurende 30 tot 45 minuten aan de lucht. Centrifugeer de geprepareerde muizenlijnnegatieve HSPC's bij 200 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de celkorrel in het juiste testmedium en centrifugeert u de celsuspensie opnieuw. Herhaal deze procedure nog een keer en resuspend de cellen in het juiste verwarmde testmedium tot de concentratie van 250.000 cellen per 50 microliter of vijf miljoen cellen per milliliter. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 microliter van de celsuspensie toe te voegen langs de zijkant van elke put van de met cellijm beklede 96-well celkweekmicroplaat en voeg vervolgens 50 microliter van het testmedium toe aan de hoekachtergrondmeetputten.

Maak een centrifugebalansplaat door 50 microliter water toe te voegen per put van een niet-gecoate 96-well celkweekmicroplaat. Centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 200 maal G. Incubeer de plaat in een niet-koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 25 tot 30 minuten voor celaanhechting.

Bevestig na 30 minuten visueel onder een microscoop dat de cellen stabiel aan het microplaatoppervlak zijn gehecht. Begin met het bereiden van alle vereiste oplossingen in het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium zoals vermeld in het tekstmanuscript en verwijder de gehydrateerde sensorcartridge uit de incubator. Til de sensorcartridge uit het kalibrant en vervang deze op dezelfde gebruiksplaat met de kalibrant om de luchtbellen te verwijderen.

Plaats de 80-laadgeleider plat op de bovenkant van de sensorcartridge en oriënteer deze zodat de letter A zich in de linkerbovenhoek bevindt. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 20 microliter 100 millimolaire glucoseoplossing in poort A. Vervang de 80-laadgeleider plat door de BC-laadgeleider plat, waarbij u de letter B in de linkerbovenhoek oriënteert. Doseer 22 microliter van 20 micromolaire oligomycine-oplossing in poort B.Heroriënteer de BC-laadgeleider plat om de letter C in de linkerbovenhoek te lokaliseren voor het laden van poort C en doseer 25 microliter van 500 millimolar 2-deoxy-d-glucoseoplossing in poort C. Verwijder en gooi vervolgens de laadgeleiderflats weg.

Maak of laad nu de sjabloon voor de glycolyse-stresstest op de controller. Voer de details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op Groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd.

Zorg er in het protocol voor dat kalibratie en evenwicht worden gecontroleerd in de initialisatiestap. Stel voor de nulmeting en metingen na elke injectie het aantal meetcycli in op drie en meng, wacht, meet tijden op drie minuten, nul minuten, drie minuten. Klik op Start Uitvoeren in de software.

Verwijder het deksel van de met verbindingen geladen en gehydrateerde sensorcartridge en plaats deze op de werklade van de extracellulaire fluxanalysator. Begin de kalibratierun. Haal de microplaat met de zaadcellen uit de couveuse.

Zonder de cellen te storen, voegt u langzaam 130 microliter van het voorverwarmde glycolyse-stresstesttestmedium per put toe om het gemiddelde volume in elke put tot 180 microliter te maken en breng de plaat nog eens 15 tot 20 minuten terug naar de incubator. Klik op Lade openen in de software om de thermische lade van Seahorse te openen. Nadat de kalibratie is voltooid, vervangt u de gebruiksplaat door deze testmicroplaat met de cellen en drukt u op de loadcelplaat om de metingen te starten.

Nadat de metingen zijn voltooid, verwijdert u het testmedium van de plaat zonder de cellen te storen en wast u ze voorzichtig met 250 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder de cellen te ontwrichten. Voeg nu 10 microliter radioimmunoprecipitatie lysisbuffer aangevuld met 1X proteaseremmer cocktail toe aan elke put en roer de plaat gedurende 10 minuten op een shaker. Vries de hele plaat in bij min 80 graden Celsius.

Ontdooi de plaat en voer een eiwitmeting uit voor gegevensnormalisatie volgens de instructies van de fabrikant. Haal de gegevens op en analyseer deze door het gegevensbestand te openen met de Wave-desktopsoftware. Klik op Normaliseren, plak de normalisatiewaarden voor elk putje en klik vervolgens op Toepassen om de gegevens te normaliseren.

Klik op Exporteren en selecteer glycolyse stresstestrapportgenerator om de geanalyseerde gegevens naar een rapportgenerator te exporteren. De niet-glycolytische verzuring stijgt met een verhoogd celgetal van 50.000 tot 250.000, maar neemt slechts minimaal toe tussen 200.000 en 250.000. Injectie van 10 millimolaire glucose stimuleert glycolyse bij alle celaantallen met een maximale toename van ECAR waargenomen bij 250.000 cellen per put.

Injectie van twee micromolair oligomycine verhoogt de ECAR echter niet verder. De OCR-gegevens verkregen in dezelfde reeks glycolyse-stresstests tonen een significante daling na oligomycine-injectie als gevolg van complex 5-remming. Glycolyse stress testparameters werden berekend en 250.000 cellen per put in twee micromolaire oligomycine werden geselecteerd voor verdere studies.

De mitochondriale stresstest toonde aan dat twee micromolaire oligomycine-injectie een significante vermindering van OCR veroorzaakt via de remming van complex 5. FCCP stimuleert OCR in HSPC's op een dosisafhankelijke manier met een maximale toename waargenomen bij twee micromolair. Een mengsel van 0,5 micromolair rotenon en 0,5 micromolair antimycine A-injectie verlaagt OCR tot het minimale niveau dat overeenkomt met het niet-mitochondriale zuurstofverbruik.

Mitochondriale stresstestparameters werden berekend en twee micromolaire FCCP werd geselecteerd voor verdere studies. Gezien de hoge doorvoer van deze techniek, kan het hier beschreven protocol gemakkelijk worden aangepast om een groot aantal bio-energetische modulatoren in hematopoëtische stamcellen, hematopoëtische voorlopers en kwaadaardige hematopoëtische cellen te screenen. Zeepaardjesanalyse wordt veel gebruikt in de literatuur om het metabolisme in een breed scala van contexten te meten in de aanwezigheid van verschillende substraten en remmers.