Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Deze methode kan worden gebruikt om onderzoekers te helpen bij het analyseren en tellen van co-culturen van cellen met behulp van een eenvoudige en effectieve gebiedsgebaseerde analyse. Deze techniek is relatief eenvoudig te implementeren met behulp van algemeen beschikbare software en biedt een betrouwbare en nauwkeurige manier om verschillende celtypen binnen een co-cultuuromgeving te identificeren. Deze methode kan inzicht geven in hoe specifieke co-culturen van cellen synergetisch samenwerken om te helpen bij weefselregeneratie.

Deze methode kan ook worden gebruikt om monocultuur biomarker studies te valideren. Om te beginnen kweekt u ruwe 264,7 macrofagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor monocultuurbeeldvorming in één milliliter DMEM aangevuld met FBS, penicilline-streptomycine, natriumbicarbonaat en bèta-mercaptoethanol in een celkweekkolf van vijf milliliter met een dichtheid van 25.000 cellen per vierkante centimeter. Kweek NIH/3T3 cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline-streptomycine.

Voor co-kweek beeldvorming, kweek ruwe 264.7 macrofagen en NIH / 3T3 fibroblasten met behulp van co-kweek medium met een deel ruwe 264.7 medium en een deel NIH / 3T3 medium samen in verschillende verhoudingen en totale dichtheid van 25.000 cellen per centimeter vierkant. Na het zaaien incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om een levensvatbare celdichtheid van 80% celconfluentie te bereiken. Om celbeelden te verkrijgen met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met het 40X-objectief, bepaalt u de capaciteit van het algoritme om afbeeldingen met een reeks beeldkwaliteiten nauwkeurig te evalueren.

Verkrijg afbeeldingen in grijstinten met verschillende foci die zowel niet-bulbus- als bulbusafbeeldingen produceren en exporteer ze in het raw czi-bestand. Als u afbeeldingen van cellen wilt verkrijgen met behulp van de gebiedsgebaseerde methode, kopieert en plakt u het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voert u de bestandsnaam in door de opdracht uit te voeren. Druk op Uitvoeren om het programma te starten.

Analyseer de beelden door te openen door reconstructie, gevolgd door te sluiten door reconstructie met behulp van bronfuncties om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten door het betreffende commando uit te voeren. Om de gereconstrueerde afbeeldingen te binariseren met behulp van een op percentielen gebaseerd identificatiesysteem, onderscheidt u cellen van de achtergrond door een percentielverschil te gebruiken met de maximale relevante pixel met de grootste pixelwaarde die ten minste 0,5% van een bepaalde afbeelding omvat. Analyseer en evalueer de pixelwaarden voor onbewerkte 264,7-macrofagen en zorg ervoor dat de waarden zich binnen 4,5% van de maximale relevante pixel bevinden.

Markeer vervolgens de pixel als mobiel. Voor afbeeldingen die bulbuscelprofielen bevatten, implementeert u een iteratieve procedure om te corrigeren voor foutieve binarisatie in de centra van de cellen. Bepaal een eerste schatting voor de totale celdekking.

Voer het algoritme uit en analyseer afbeeldingen met behulp van de eerste schattingen van alfa en kappa om een deel van de eilanden te vullen. Gebruik vervolgens de celtellingen en dekking na de analyse om kappa opnieuw te berekenen. Om het gemiddelde celoppervlak te bepalen na binarisatie van de afbeelding, verkrijgt u een vector van alle centrale locaties en stralen van cirkels in de afbeelding door de opdracht uit te voeren.

Gebruik de radii-uitgangen om het gemiddelde celoppervlak te berekenen door ten minste 10 cellen te gemiddelden en te analyseren om een nauwkeurige gebiedsidentificatie te garanderen. Voer de afbeeldingsanalyse uit met behulp van de opdrachten zoals eerder beschreven. Voer vervolgens een analyse uit van co-culturen die ruwe 264.7- en NIH / 3T3-cellen bevatten door experimenteel een parameter phi te bepalen met behulp van afbeeldingen van onbewerkte 264.7- en NIH / 3T3-cellen.

Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met de handmatige tellingen die specifiek zijn voor de ruwe 264.7- en NIH / 3T3-co-cultuur. Bepaal ruwe 264,7 celtellingen in totale celdekking zoals eerder beschreven voor de monocultuurbeelden. Analyseer het omvormde beeld van de waterscheiding opnieuw zonder de phi-parameter en detecteer zowel macrofagen als fibroblasten.

Verkrijg NIH/3T3 fibroblastgegevens door selectief ruwe 264,7 celpixels af te trekken die zijn verkregen met behulp van de standaarddrempel- en gebiedsgebaseerde kwantificeringsmethoden die eerder zijn beschreven. Analyse van niet-bulbus ruwe 264.7 macrofagen werd uitgevoerd en algoritme-outputs werden geregistreerd. Gemiddelde gebiedsberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 226 cellen, terwijl een handmatige telling 241 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 6% Analyse van bulbus ruwe 264,7 macrofagen werd ook uitgevoerd.

De gemiddelde oppervlakteberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 221 cellen, geverifieerd door een handmatige telling van 252 cellen met een geschatte foutwaarde van 12% Analyse van co-culturen die zowel ruwe 264,7 macrofagen als NIH / 3T3 fibroblasten bevatten, werd uitgevoerd. Algoritme-uitgangen voor het ruwe 264,7 macrofaaggetal waren 137, terwijl een handmatige telling 155 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 11% Om de robuustheid van het celtelalgoritme te bepalen, werden vijf onbewerkte 264,7 macrofagenafbeeldingen geteld door automatische celidentificatie en handmatige gebruikerstellingen. De dobbelsteencoëfficiënt werd verkregen met een gemiddelde parameter van 0,85 over vijf afbeeldingen.

De cruciale stap binnen dit protocol is het gebruik van op percentielen gebaseerde parameters die robuuste celdetectie mogelijk maken in zowel monocultuur- als co-cultuurbeelden. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen van belang te identificeren voor verdere analyse met behulp van moleculair biologische technieken om biomarkers te beoordelen die specifieke celpopulaties en biomarkerontwikkeling in co-cultuursystemen definiëren.