Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen
15 februari 2022
We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.
Deze methode kan worden gebruikt om onderzoekers te helpen bij het analyseren en tellen van co-culturen van cellen met behulp van een eenvoudige en effectieve gebiedsgebaseerde analyse. Deze techniek is relatief eenvoudig te implementeren met behulp van algemeen beschikbare software en biedt een betrouwbare en nauwkeurige manier om verschillende celtypen binnen een co-cultuuromgeving te identificeren. Deze methode kan inzicht geven in hoe specifieke co-culturen van cellen synergetisch samenwerken om te helpen bij weefselregeneratie.
Deze methode kan ook worden gebruikt om monocultuur biomarker studies te valideren. Om te beginnen kweekt u ruwe 264,7 macrofagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor monocultuurbeeldvorming in één milliliter DMEM aangevuld met FBS, penicilline-streptomycine, natriumbicarbonaat en bèta-mercaptoethanol in een celkweekkolf van vijf milliliter met een dichtheid van 25.000 cellen per vierkante centimeter. Kweek NIH/3T3 cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline-streptomycine.
Voor co-kweek beeldvorming, kweek ruwe 264.7 macrofagen en NIH / 3T3 fibroblasten met behulp van co-kweek medium met een deel ruwe 264.7 medium en een deel NIH / 3T3 medium samen in verschillende verhoudingen en totale dichtheid van 25.000 cellen per centimeter vierkant. Na het zaaien incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om een levensvatbare celdichtheid van 80% celconfluentie te bereiken. Om celbeelden te verkrijgen met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met het 40X-objectief, bepaalt u de capaciteit van het algoritme om afbeeldingen met een reeks beeldkwaliteiten nauwkeurig te evalueren.
Verkrijg afbeeldingen in grijstinten met verschillende foci die zowel niet-bulbus- als bulbusafbeeldingen produceren en exporteer ze in het raw czi-bestand. Als u afbeeldingen van cellen wilt verkrijgen met behulp van de gebiedsgebaseerde methode, kopieert en plakt u het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voert u de bestandsnaam in door de opdracht uit te voeren. Druk op Uitvoeren om het programma te starten.
Analyseer de beelden door te openen door reconstructie, gevolgd door te sluiten door reconstructie met behulp van bronfuncties om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten door het betreffende commando uit te voeren. Om de gereconstrueerde afbeeldingen te binariseren met behulp van een op percentielen gebaseerd identificatiesysteem, onderscheidt u cellen van de achtergrond door een percentielverschil te gebruiken met de maximale relevante pixel met de grootste pixelwaarde die ten minste 0,5% van een bepaalde afbeelding omvat. Analyseer en evalueer de pixelwaarden voor onbewerkte 264,7-macrofagen en zorg ervoor dat de waarden zich binnen 4,5% van de maximale relevante pixel bevinden.
Markeer vervolgens de pixel als mobiel. Voor afbeeldingen die bulbuscelprofielen bevatten, implementeert u een iteratieve procedure om te corrigeren voor foutieve binarisatie in de centra van de cellen. Bepaal een eerste schatting voor de totale celdekking.
Voer het algoritme uit en analyseer afbeeldingen met behulp van de eerste schattingen van alfa en kappa om een deel van de eilanden te vullen. Gebruik vervolgens de celtellingen en dekking na de analyse om kappa opnieuw te berekenen. Om het gemiddelde celoppervlak te bepalen na binarisatie van de afbeelding, verkrijgt u een vector van alle centrale locaties en stralen van cirkels in de afbeelding door de opdracht uit te voeren.
Gebruik de radii-uitgangen om het gemiddelde celoppervlak te berekenen door ten minste 10 cellen te gemiddelden en te analyseren om een nauwkeurige gebiedsidentificatie te garanderen. Voer de afbeeldingsanalyse uit met behulp van de opdrachten zoals eerder beschreven. Voer vervolgens een analyse uit van co-culturen die ruwe 264.7- en NIH / 3T3-cellen bevatten door experimenteel een parameter phi te bepalen met behulp van afbeeldingen van onbewerkte 264.7- en NIH / 3T3-cellen.
Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met de handmatige tellingen die specifiek zijn voor de ruwe 264.7- en NIH / 3T3-co-cultuur. Bepaal ruwe 264,7 celtellingen in totale celdekking zoals eerder beschreven voor de monocultuurbeelden. Analyseer het omvormde beeld van de waterscheiding opnieuw zonder de phi-parameter en detecteer zowel macrofagen als fibroblasten.
Verkrijg NIH/3T3 fibroblastgegevens door selectief ruwe 264,7 celpixels af te trekken die zijn verkregen met behulp van de standaarddrempel- en gebiedsgebaseerde kwantificeringsmethoden die eerder zijn beschreven. Analyse van niet-bulbus ruwe 264.7 macrofagen werd uitgevoerd en algoritme-outputs werden geregistreerd. Gemiddelde gebiedsberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 226 cellen, terwijl een handmatige telling 241 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 6% Analyse van bulbus ruwe 264,7 macrofagen werd ook uitgevoerd.
De gemiddelde oppervlakteberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 221 cellen, geverifieerd door een handmatige telling van 252 cellen met een geschatte foutwaarde van 12% Analyse van co-culturen die zowel ruwe 264,7 macrofagen als NIH / 3T3 fibroblasten bevatten, werd uitgevoerd. Algoritme-uitgangen voor het ruwe 264,7 macrofaaggetal waren 137, terwijl een handmatige telling 155 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 11% Om de robuustheid van het celtelalgoritme te bepalen, werden vijf onbewerkte 264,7 macrofagenafbeeldingen geteld door automatische celidentificatie en handmatige gebruikerstellingen. De dobbelsteencoëfficiënt werd verkregen met een gemiddelde parameter van 0,85 over vijf afbeeldingen.
De cruciale stap binnen dit protocol is het gebruik van op percentielen gebaseerde parameters die robuuste celdetectie mogelijk maken in zowel monocultuur- als co-cultuurbeelden. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen van belang te identificeren voor verdere analyse met behulp van moleculair biologische technieken om biomarkers te beoordelen die specifieke celpopulaties en biomarkerontwikkeling in co-cultuursystemen definiëren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het analyseren en tellen van co-cultures van cellen met behulp van een op gebied gebaseerde benadering voor beeldanalyse. De techniek is ontworpen om eenvoudig en effectief te zijn en biedt betrouwbare identificatie van verschillende celtypen binnen een co-cultuursetting.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Beeldanalyse
- Weefselregeneratie
Achtergrond
- Co-cultures van cellen kunnen inzicht geven in cellulaire interacties.
- Verschillende celtypen vertonen aanzienlijke structurele verschillen.
- Accurate celtelling is cruciaal voor het begrijpen van co-cultuurdynamica.
- Bestaande methoden kunnen betrouwbaarheid of gemak van implementatie missen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor effectieve celtelling in co-cultures.
- Om het begrip van hoe specifieke celtypen synergiseren te verbeteren.
- Om monocultuur biomarker studies te valideren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van op gebied gebaseerde beeldanalyse voor celidentificatie.
- Cultuur van raw 264.7 macrofagen en NIH/3T3 cellen.
- Implementatie van een adaptief algoritme voor analyse.
- Gebruik van wijd beschikbare software voor gemakkelijke toepassing.
Belangrijkste resultaten
- De methode biedt betrouwbare en nauwkeurige celtellingen.
- Het onderscheidt effectief tussen verschillende celtypen.
- Inzichten in weefselregeneratiemechanismen werden verkregen.
- Validatie van monocultuur studies werd bereikt.
Conclusies
- De op gebied gebaseerde analysemethode is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers.
- Het vereenvoudigt het proces van het analyseren van co-cultures.
- De techniek kan onderzoeken in celbiologie en weefselengineering verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of heterogeneous cell populations is critical for de-risking target validation in tissue regeneration and fibrosis research. This area-based image analysis algorithm enables reliable distinction and counting of macrophage-fibroblast cocultures, supporting mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular interaction studies. The method provides predictive confidence in early discovery by delivering quantitative, reproducible readouts essential for go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying macrophage and fibroblast contributions in coculture systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible, error-bounded cell counting (<10% error margin) in complex co-culture environments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative data on cell-type-specific responses to modulators or genetic perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness in high-density seeding conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via percentile-based thresholding and iterative correction for non-ideal cell morphologies.
- Scalability: Enables platform reuse across varying coculture ratios and image qualities using widely available MATLAB-based tools.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling analysis of cocultures central to tissue regeneration pathways.
- Mechanistic De-risking: Isolates fibroblast and macrophage contributions via selective exclusion algorithms, clarifying pathway-specific effects.
- Preclinical Readiness: Provides validated cell counts that inform biomarker assessment and molecular analysis of specific populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for quantifying stromal-immune interactions in fibrosis and wound healing models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate phenotyping of macrophage-fibroblast cocultures.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in coculture systems.
- Analytics: Generates measurements (cell counts, coverage, area) that allow teams to compare conditions and assess biological responses.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by enabling analysis of cocultures in tissue regeneration contexts.
- Enterprise Reuse: Frameworks the method as a scalable, standardized tool applicable across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in coculture systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across varying image qualities and cell densities.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in fibrosis and regeneration programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, reproducible coculture phenotyping data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and MATLAB programming for algorithm implementation and parameter tuning.
- Dependent on inverted microscopy with 40X objective and grayscale image acquisition capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols (focus, lighting, file format) for consistent algorithm performance.
- Requires adaptation of parameters (phi, alpha, kappa) when applied to different cell types or coculture ratios.
- Practical limitation: Algorithm accuracy depends on sufficient height differences between cell types for effective segmentation.
