Name: Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Leer celsubstraatadhesie en celvormindex kwantificeren in MCF7-monolagen met behulp van confocale microscopie en ImageJ-analyse. Deze methode ondersteunt betrouwbaar kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Poolse National Science Center onder grant nr.

1. Voorbereidende stappen
<ol><li>Celzaaien om confluent monolagen te verkrijgen<ol>
<li>Vóór het zaaien, bestrijk de putten van een 4-putten kamer dia met collageen I (of andere ECM component van keuze). Voor collageen I coating, volg een commercieel protocol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html bij een concentratie van 8 μg/cm2.</li>
		<li>Zaad 400.000 cellen tot een put van een 4-well kamer dia.</li>
		<li>Kweek de cellen 24 uur (of langer, afhankelijk van de experimentele eindpunten) voordat ze vlekken, in een couveuse bij 37 °C, 5% CO2. Deze stap zorgt voor een rijping van celcelcontacten en de vorming van monolagen.</li>
		<li>Gebruik een optische, omgekeerde microscoop om samenvloeiing te verifiëren (ongeveer 90% is vereist) en een algemene conditie van monolagen. Ga niet verder als cellen zweven of gestrest lijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunofluorescerende kleuring OPMERKING: Cellen kunnen worden gekleurd met een protocol naar keuze. Hier werd immunofluorescentie uitgevoerd zoals eerder beschreven4.<ol>
<li>Voor focale hechtingsanalyse, vlek de cellen met een focale hechting eiwit van keuze (in dit protocol paxilline). Voor celvormanalyse vlek met cel-cel junction eiwit van keuze (in dit protocol desmosomal eiwit plakoglobine).</li>
		<li>Gebruik voor de procedure 0,5 mL van gespecificeerde oplossingen, tenzij anders gespecificeerd.</li>
		<li>Fix cellen in 4% formaldehyde in PBS voor 30 min op ijs.</li>
		<li>Incubeer met 0,1 M ammoniumchloride (in PBS) gedurende 10 minuten om autofluorescentie te blussen.</li>
		<li>Voeg 0,5% Triton X-100 (in PBS) toe voor 30 min (permeabilisatie).</li>
		<li>Blok met 5% melk (of 1% BSA) in TBS-T voor 1 uur.</li>
		<li>Incubaal met primair antilichaam bij 4 °C 's nachts (anti-paxillin: konijn, 1:250, anti-plakoglobine: konijn, 1:400)</li>
		<li>Incubeer met secundair antilichaam gedurende 30 min (Alexa Fluor 594 geit anti-konijn, 1:500, 1:500)</li>
		<li>Vlek met 300 nM DAPI gedurende 1-5 min, beschermd tegen licht. OPMERKING: Eventueel kan extra kleuring van actine met fluorescerende phalloïdenconjugaten (conc. 1:400) worden uitgevoerd; phalloidine moet worden toegevoegd in dezelfde stap als het secundaire antilichaam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocale beeldvorming<ol>
<li>Maak afbeeldingen van enkele Z-segmenten met behulp van een confocale microscoop (bijvoorbeeld Zeiss LSM800). OPMERKING: Optionele actin kleuring kan helpen bij het beoordelen van de juiste brandpuntsvlak. Corticale actin kleuring is aanwezig in het apicale gebied, terwijl actin stress vezels aanwezig zijn in het basale gebied, in de buurt van het substraat, zoals geïllustreerd op figuur 1.</li>
		<li>Focale adhesiebeeldvorming<ol>
<li>Kies Z-segmenten voor focale hechtingsanalyse van het basale gebied, dicht bij het substraat.</li>
			<li>Gebruik een doelstelling met het hoogste numerieke diafragma beschikbaar (bij voorkeur 63x N.A.: 1.4). LET OP: De vorm van FA is zeer specifiek en gemakkelijk herkenbaar. Het wordt dus aanbevolen om de scan te starten vanaf een brandpuntsvlak onder de cellen en vervolgens langzaam naar hen toe te scannen, totdat FA's duidelijk zichtbaar zijn. Beeldanalyse zal nauwkeuriger zijn van kleinere gezichtsvelden, die meestal uniformer zijn, maar dit impliceert dat minder cellen in één gezichtsveld worden berekend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Beeldvorming van celcellencontacten<ol>
<li>Gebruik een doelstelling van 40x of 63x.</li>
			<li>Selecteer kanalen voor nucleaire kleuring en de gewenste kruising eiwit kleuring.</li>
			<li>Kies Z-segmenten voor celvormanalyse uit het apicale gebied van de monolagen.</li>
			<li>Maak foto's voor ten minste 3 verschillende gezichtsvelden (200-400 cellen).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beeldanalyse
OPMERKING: Op voorwaarde dat macro's optimaal werken op ImageJ-versie 1.50f of nieuwer. Gebruik alleen voor kwantificering van beelden met een hoge signaal-ruisverhouding en zonder onder- of oververzadigde pixels. De beschreven methoden omvatten stappen die handmatige parameteraanpassing vereisen. Zo wordt een blinde analyse/geblindeerde experiment setup aanbevolen. Voor het versleutelen van afbeeldingsbestandsnamen kunnen ImageJ-plug-ins zoals "Blind Analysis Tool" (beschikbaar op: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) worden gebruikt.
<ol><li>Focale adhesieanalyse OPMERKING: De aanbevolen invoerbestanden voor de volgende methoden zijn: afbeeldingen van FA's die worden weergegeven in 8-bits grijswaarden die zijn opgeslagen in de indeling .tiff.<ol><li>Open afbeelding met ImageJ.</li>
		<li>De schaal van een afbeelding instellen op pixels(Analyseren | Schaal instellen; Schaal verwijderen en de optie Globaal controleren).</li>
		<li>Neem de bestandsnaam en het gebied van ROI op in meetopties(Analyseren | Metingen instellen...); de opties Area en Display-label.</li>
		<li>Achtergrond aftrekken (Proces | Achtergrond aftrekken; de parameter Rolling ball radius instellen op 50 pixels; check Sliding paraboloid optie). In het geval van pseudocolored RGB-afbeeldingen: split RGB-kanalen, laat het kanaal met FAs geopend, sluit de resterende kanalen (Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen).</li>
		<li>Bepaal het gebied van het kleinste interessegebied (ROI). Met behulp van uit de vrije hand of polygoon selecties schetsen de kleinste enkele brandpuntshechting en meet het gebied (Analyseren | maatregel). Herhaal deze stap voor verschillende ROI's (FA's) van een paar willekeurig gekozen afbeeldingen (voor een totaal van 20 ROI's). Bereken en bewaar het gemiddelde van de verkregen resultaten. OPMERKING: Deze stap is alleen vereist wanneer een bepaalde set afbeeldingen voor het eerst wordt geanalyseerd (specifieke cellijn, coatingdia's met specifieke extracellulaire matrixcomponenten, verschillende kweekomstandigheden).</li>
		<li>Afbeelding converteren naar binair met behulp van een van de volgende methoden:<ol>
<li>De algemene drempel instellen (Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde; controleer standaard- en b&w- en donkere achtergrondopties, pas de drempel handmatig aan of stel deze automatisch in).</li>
			<li>De lokale drempel instellen (Afbeelding | Aanpassen | Automatische lokale drempelwaarde...; stel methode in op Phansalkar en controleer Witte objecten op de optie zwarte achtergrond. Vervolgens de afbeelding omkeren (Bewerken | Omkeren).</li>
		</ol></li>
		<li>Meet het aantal en het gebied van ROI's. Selecteer Analyseren | Deeltjes analyseren; Pixeleenheden, Weergaveresultaten, Resultaten wissen en Opties voor samenvatten, de parameter Grootteinstellen , als een ondergrens gebruiken het gemiddelde van de kleinste ROI's vanaf stap 2.1.5. De bovenste grens kan worden ingesteld op 25% van een typisch celgebied.</li>
		<li>Overdrachtsgegevens (waaronder afbeeldingsnaam, aantal FA's, totaal en gemiddeld gebied van FA's; respectievelijk Slice, Aantal, Totaalgebied, Gemiddelde grootte)van het overzichtsvenster naar het gegevensbeheerprogramma naar keuze.</li>
		<li>Bepaal het aantal cellen per afbeelding door de met DAPI-gekleurde kernen te tellen. Tellen kan handmatig worden gedaan (Plugins | Analyseren | Celteller)of zoals in beschikbare protocollen zoals: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.</li>
		<li>Als alternatief, om het tellen van de FA's te vergemakkelijken, gebruik de bijgevoegde ImageJ macro (FAs.ijm).<ol>
<li>Verplaats .ijm-bestand met de macro naar plug-ins of macro's map in ImageJ bronbestanden mappen.</li>
			<li>Bepaal een gebied met de kleinste ROI zoals beschreven in stap 2.1.4.</li>
			<li>Macrobestand openen (Plug-ins | Macro's | Edit...).</li>
			<li>Voordat de macro wordt uitgevoerd, stelt u de waarde van drie variabelen in: vulwaarde van area_of_the_smallest_region_of_interest met een getal dat is verkregen tijdens stap 2.1.4. Stel threshold_type waarde in op handmatig of automatisch.</li>
			<li>Wijzigingen opslaan (de macro moet klaar zijn voor gebruik).</li>
			<li>Bel de macro vanuit het deelvenster ImageJ of maak er een snelkoppeling naar. De macro begint met het standaard geopende dialoogvenster. Selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt. OPMERKING: In het geval van handmatige drempelaanpassing is handmatige bevestiging van de drempelwaarde vereist (voorkom wijzigingen met de knop Toepassen in het dialoogvenster Drempelwaarde, gebruik in plaats daarvan het aangepaste dialoogvenster Actie vereist). De resultaten die worden verkregen door met de macro te werken, zijn dezelfde als die beschreven in stap 2.1.8 (opgenomen in het dialoogvenster Samenvatting). Bovendien wordt in het geval van handmatige drempelaanpassing het lagere drempelniveau weergegeven in een dialoogvenster Logboek, omdat deze waarde het mogelijk maakt om verkregen resultaten in de toekomst te reproduceren indien nodig. Aanvullende cijfers S1 en S2 werden opgenomen als trainingsdataset voor de FAs.ijm macro.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Celvormanalyse<ol>
<li>Handmatig<ol>
<li>Open een afbeelding in ImageJ of een andere software voor beeldverwerking met een vergelijkbare set functies (verdere instructies hebben betrekking op ImageJ). Kies de parameters die moeten worden gemeten door te selecteren in het menu Analyse | Stel Metingen en aanvinkende vormbeschrijvingen in het selectievakje in.</li>
			<li>Verwijder handmatig celranden, gemarkeerd door knooppunteiwit(s) naar keuze, met behulp van het pictogram Selecties uit de vrije hand. De gekozen parameters worden automatisch berekend voor elke cel. Sla de resultaten op nadat u elke cel hebt uiteengezet door op Bewerken te klikken | Selectie | Toevoegen aan manager. Alleen volledige, volledig zichtbare cellen, met ononderbroken randen moeten worden geteld.</li>
			<li>Wanneer alle cellen in het gezichtsveld worden beschreven, maakt u de meting door alle getallen te markeren die in het linkervak van de ROI-manager (overeenkomend met cellen) worden weergegeven en op Meten klikken De resultaten worden weergegeven in het vak Resultaten en kunnen worden overgebracht naar de spreadsheet naar keuze.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Geautomatiseerde OPMERKING: Om de kwantificering van celvormbeschrijvingen (CSI, aspect ratio, rondheid, degelijkheid) te vergemakkelijken is een ImageJ macro opgesteld en aan dit artikel gehecht (CSI.ijm). De macro is voornamelijk gebaseerd op ImageJ plugin genaamd MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. De macro voert de volgende stappen uit: 1) Uitbreiding van elke rand van de afbeelding met 10 zwarte pixels [MorpholibJ]; 2) Rondes van dilataties en erosies - morfologische filter [MorpholibJ]; 3) Generatie van binair beeld van cellengrenzen door morfologische segmentatie [MorpholibJ]; 4) Verwijding van celgrenzen; 5) Inversie van pixelswaarde; 6) Het genereren van selecties en het meten van het gebied en de omtrek van cellen op de afbeelding; en 7) Afbeelding opslaan met geschetste cellen en ImageJ ROI-selecties in een nieuw bestand.<ol>
<li>Verplaats het .ijm-bestand met de macro naar de map plug-ins of macro's in de mappen van ImageJ-bronbestanden. Bel de macro vanuit het deelvenster ImageJ of maak er een snelkoppeling naar.</li>
			<li>Bepaal vóór de kwantificering van een nieuwe gegevensset de waarden van de kleinste en grootste regio's van belang. Overzicht (uit de vrije hand of polygoon selectie) een paar (3-10) voorbeelden van de kleinste en de grootste cellen op de afbeelding en vervolgens meten hun gebied (Analyseren | maatregel).</li>
			<li>U ook de macro uitvoeren met standaardinstellingen (de limiet voor de lagere grootte is ingesteld op 0 en de bovengrens is ingesteld op oneindig), wacht tot de macro is voltooid en selecteer De optie Celgroottegrenzen instellen. Meet het gebied van de kleinste en grootste cellen door op hun label te klikken en druk vervolgens op Meten in de ImageJ ROI Manager. Stel de waarde in van the_smallest_cell- en the_biggest_cell variabelen. Sla wijzigingen op, sluit alle macrodialoogvensters en voer de macro opnieuw uit. OPMERKING: De macro kan worden gebruikt zonder ROI-groottegrenzen in te stellen, maar wordt niet aanbevolen omdat het de kans op het meten van ongepaste celfragmenten of celclusters aanzienlijk vergroot.</li>
			<li>Start de macro met het standaard dialoogvenster Openen. Selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt (grijswaarden).</li>
			<li>Analyseer de resultaten. De uitvoer die door de macro wordt geleverd, bestaat uit: tabel van de resultaten (cellabel, afbeeldingslabel, celgebied [pixels2], celomtrek [pixels2],circulariteit [CSI], beeldverhouding, rondheid, stevigheid), afbeelding met overzichtse cellen en ROI-selectieslijst (die ook in nieuw bestand in de submap Resultaten wordt opgeslagen). De resultatentabel wordt automatisch gekopieerd naar het klembord van de gebruiker. LET OP: Aanvullende cijfers S3 en S4 zijn opgenomen als trainingsdataset voor de CSI.ijm macro.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kwantificering
<ol><li>Kwantificering van DE's<ol>
<li>Bereken het gemiddelde FA's-getal en de gemiddelde FA-grootte per cel/kern. OPMERKING: Voor sommige cellijnen is het mogelijk om FA's afzonderlijk te tellen in afzonderlijke cellen. Voor cellijnen die sterke celcelcontacten hebben en groeien als monolagen zoals MCF7, kunnen het aantal en de grootte van FA's per cel worden berekend door de waarden die zijn verkregen uit FA's te delen door het aantal kernen in de hele afbeelding.</li>
		<li>Statistische significantie van potentiële verschillen tussen populaties (experimentele groepen) beoordelen. Afhankelijk van de verdeling en variantie van de gegevens, voor de vergelijking van de twee verschillende groepen gebruiken Student t-test (normale verdeling) of niet-parametrische U-test (Mann-Whitney). Voor de vergelijking van meerdere groepen gebruik maken van one-way ANOVA of Kruskal-Wallis in combinatie met de juiste post-hoc tests.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celvormanalyse<ol>
<li>Berekening van vormbeschrijvingen<ol>
<li>Handmatige analyse: Bereken de cel shape-index (CSI, ook wel circulariteit of celvorm genoemd) in de keuzespreadsheet voor elke gemeten cel vanuit het juiste gebied en omtrek met behulp van de formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61461/61461equ01.jpg"> OPMERKING: CSI gaat uit van waarden tussen 1 (cirkelvormig) en 0 (langwerpig). De voorbeelden van verschillende celvormen (met hetzelfde gebied) en hun respectieve CSI's worden gepresenteerd in figuur 2. In geautomatiseerde analyse worden de waarden van vormbeschrijvingen (aangeworven en hieronder gedefinieerd) automatisch berekend en in het resultaatvak weergegeven: (1) CSI = 4π*gebied/(perimeter)2 (2) AR = belangrijke as/kleine as (3) Rondheid = 4*oppervlakte/π*(belangrijke as)2 (4) Stevigheid = oppervlakte/bolle gebied</li>
		</ol>
</li>
		<li>Histogrammen van celvormverdeling<ol>
<li>Plot celvormverdeling als histogram van circulariteit (CSI). Classificeer cellen op basis van hun CSI-waarde (berekend voor het minimum van 200-400 cellen), tot een van de tien uniforme intervallen (bereik: 0-1, bakbreedte: 0,1). Het histogram geeft het aantal cellen in elke categorie weer. OPMERKING: Het histogram met vormverdeling van de typische MCF7-cellaag toont een piek van ongeveer 0,7-0,8 CSI. Als de vorm van de cellen wordt vervormd door een bepaalde factor (bijvoorbeeld paclitaxel behandeling, die G2/M fase arrestatie veroorzaakt en in het gevolg meer cellen zijn rond) moet worden weerspiegeld op het histogram.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cumulatieve verdelingskavels<ol>
<li>Vergelijk cumulatieve CSI-distributies voor elke celregel, omdat dit de beste manier is om statistisch belangrijke verschillen in celvormveranderingen (of andere wijzigingen in de distributie) te beoordelen. Het kan bijvoorbeeld worden toegepast om de veranderende verdeling van DE's bij te houden.</li>
			<li>Bereken de cumulatieve distributiefunctie (CDF) om distributies te vergelijken. CDF kent voor een bepaalde CSI-waarde (uitgezet op X-as) het percentage (of relatieve telling) toe waarvoor alle waarden kleiner of gelijk zijn aan deze CSI-waarde (uitgezet op de Y-as). Naarmate de CSI-waarde hoger wordt, wordt het percentage van de set waarden dat minder of gelijk is aan deze waarde ook hoger. CDF kan worden berekend door de statistische software van keuze, of handmatig.</li>
			<li>Voor statistische analyse, gebruik Kolgomorov-Smirnov niet-parametrische test.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006(2016).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).</li>
<li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li>
<li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP%2C+a+bisphenol+A+analog%2C+as+a+novel+AR+down-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoLibJ%3A+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li>
<li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAX1+impact+on+collective+cell+migration%2C+cell+adhesion%2C+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li>
<li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+analysis+of+cell%2C+nucleus+and+focal+adhesion+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201(2018).</li>
<li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics%2C+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707(2016).</li>
<li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li>
<li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Celcel- en celsubstraathechting vormen inherente kenmerken van de epitheelcellen en spelen de cruciale rol in weefselmorfogenese en embriogenese. In volwassen weefsels is de juiste regulatie van mechanische eigenschappen van de cellaag cruciaal bij het handhaven van homeostase en het voorkomen van pathologische reacties zoals tumorprogressie en metastase. De grootte en het aantal brandpuntsverklevingen zijn afhankelijk van de sterkte van de hechting van het celsubstraat, terwijl de celvorm afhankelijk is van contractiele...

Epitheelcelmonolagen fungeren als een collectief waarin celcel- en celsubstraathechting en contractielkrachten en spanningen belangrijke parameters vertegenwoordigen en hun juiste evenwicht bijdraagt aan de algehele integriteit van eenheid1,2,3. Het beoordelen van deze parameters is dus een manier om de huidige status van de cellaag vast te stellen.
De twee hier beschreven methoden vertegenwoordigen een tweedimensionale analyse van de samenvloeiende monolagen van aanhangende, epitheelcellen (in dit geval MCF7 borstkankercellijn). De analyse wordt uitgevoerd met behulp van confocale afbeeldingen (enkele Z-segmenten) uit verschillende regio's op de Z-as; basaal gebied in de buurt van een substraat voor focale hechting (FA) metingen en apicale regio voor celvorm metingen. De gepresenteerde methoden zijn relatief eenvoudig en vereisen standaard laboratoriumtechnieken en open-source software. Confocale microscopie is voldoende voor dit protocol, dus het kan worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van meer gespecialiseerde TIRF (Total Internal Reflection Fluorescentie) microscopie. Zo zou het protocol kunnen worden geïmplementeerd in een relatief standaard laboratoriumomgeving. Hoewel de nauwkeurigheid van de methoden beperkt is, kunnen ze basisverschillen in brandpuntshechting en celvorm onderscheiden.
Beide hier beschreven methoden bestaan uit de standaard experimentele procedures zoals celverlening, immunostaining, confocale beeldvorming en beeldanalyse uitgevoerd met ImageJ. Echter, elke beeldverwerking software met de juiste functies kan worden gebruikt. De gepresenteerde methoden kunnen veranderingen volgen en vergelijken die zijn veroorzaakt door farmacologische behandeling of minimale genetische modificatie. Het verkrijgen van bepaalde waarden wordt niet aanbevolen, vanwege de beperkte precisie van deze methoden. Twee geautomatiseerde macro's werden opgenomen, om de metingen van vele beelden te vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32740</td><td>geit anti-konijn, 1:500</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>Collageen van kalfshuid</td><td>Sigma</td><td>C9791-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), kleuring van nucleïnezuur</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-136</td><td></td></tr><tr><td>Junction plakoglobine</td><td>Cell Signaling</td><td>2309S</td><td>konijn, 1:400</td></tr><tr><td>Laminair-stroomkastje klasse 2</td><td>Alpina</td><td></td><td>standaarduitrusting</td></tr><tr><td>MCF7-gebaseerdeHAX1KD-cellijn</td><td>Cellijn opgesteld in het Nationaal Instituut voor Oncologie, Warschau, beschreven in Balcerak et al., 2019</td><td></td><td>MCF7-cellijn metHAX1knockdown</td></tr><tr><td>MCF7-cellijn (CONTROLE)</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td>epitheliale, adherente borstkankercellijn</td></tr><tr><td>Olympus CK2 lichtmicroscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paxillin</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>konijn, 1:250, Y113</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC-conjugaat</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actinelabeling</td></tr><tr><td>PTX</td><td>Sigma</td><td>T7402-1MG</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; Trizma-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-11</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM800 Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in mcf7-celmonolagen

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

De hier gepresenteerde methoden kwantificeren enkele parameters van aanhangende celmonolagen van meerdere op de juiste wijze vastgehouden confocale afbeeldingen: hechting aan het substraat als functie van het aantal en de grootte van focale verklevingen en celvorm, gekenmerkt door de celvormindex en andere vormbeschrijvingen. Focale verklevingen werden gevisualiseerd door paxilline kleuring en cel-cel grenzen werden gekenmerkt door knooppunt plakoglobine en actin. De methoden voor celkweek en kleuring waren standaard; afbeeldingen vertegenwoordigen afzonderlijke brandpuntsvlakken; beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare software voor beeldverwerking. De gepresenteerde protocollen worden gebruikt om het aantal en de grootte van focale verklevingen en de verschillen in celvormverdeling in de monolagen te kwantificeren, maar ze kunnen opnieuw worden gebruikt voor de kwantificering van de grootte en vorm van een andere afzonderlijke cellulaire structuur die kan worden gekleurd (bijvoorbeeld mitochondriën of kernen). Het beoordelen van deze parameters is belangrijk bij de karakterisering van de dynamische krachten in de hechtende cellaag, inclusief celhechting en actomyosinecontractiliteit die de celvorm beïnvloedt.

Focale adhesieanalyse De knockdown van het HAX1-gen bleek eerder van invloed te zijn op focale verklevingen6. Cellen werden gekweekt op collageen I-gecoate oppervlak voor 48 uur. Beelden van de MCF7 controlecellen en MCF7 cellen met een HAX1 knockdown(HAX1 KD) van drie onafhankelijke experimenten gekleurd met focale adhesie eiwit paxilline werden verkregen met behulp van een confocale microscoop (afbeelding van single focal plane / Z-slice basale regi...

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Dit protocol maakt kwantificering van het gebied, de omtrek en de vorm van intracellulaire structuur van het tweedimensionale beeld mogelijk. Deze techniek is snel en eenvoudig, vereist alleen standaard laboratoriuminstellingen en een confocale microscoop en maakt gebruik van opensource software. Het aantonen van de procedure zal Anna Balcerak zijn, een promovendus uit mijn laboratorium.Begin met het zaaien van vier keer 10 tot de vijfde cellen in 0,5 milliliter cultuurmedium per put in een vier-goed collageen een gecoate kamer dia voor een 24-uurs cultuur in een 37 graden Celsius en vijf graden kooldioxide incubator. De volgende ochtend, gebruik maken van een optische omgekeerde microscoop om de aanwezigheid van ten minste 90% confluent monolayer te verifiëren en gebruik een confocale microscoop om enkele Z-slice beelden te verkrijgen. Open de afbeeldingen in ImageJ voor analyse van focale hechtingen en selecteer analyseren, schaal instellen, schaal verwijderen en globaal om de afbeeldingsschaal in pixels in te stellen.Als u de bestandsnaam en het gebied van het gebied van belang wilt opnemen in de meetopties, klikt u op metingen analyseren en instellen en controleert u het gebied en de weergavelabelopties. Als u de achtergrond wilt aftrekken, selecteert u proces en trekt u de achtergrond af. Stel de rolballenstraal in op 50 pixels en controleer de glijdende paraboloïde.Als u het gebied van het kleinste interessegebied wilt bepalen, schetst u de kleinste brandpuntshechting en klikt u op analyseren en meten om het gebied te meten. Wanneer ten minste 20 regio's van belang zijn geselecteerd en gemeten, berekent en bewaart u het gemiddelde van de verkregen resultaten. Stel de bovengrens in op 25% van een typisch celgebied.Als u de afbeelding wilt overleggen aan binair, klikt u op afbeelding, past u deze aan en drempelwaarden en controleert u de standaard-, zwart-wit- en donkere achtergrond. Als u het aantal en de gebieden van de interessegebieden wilt meten, selecteert u deeltjes analyseren en analyseren en pixeleenheden controleren, resultaten weergeven, resultaten wissen en samenvatten. Breng de gegevens van het segment, het aantal en de totale gemiddelde grootte van het gebied over van het overzichtsvenster naar het programma voor gegevensbeheer naar keuze.Open voor focale adhesie kwantificering de focale adhesie ImageJ macro en betreed het gebied van het kleinste gebied van belang als het gebied van de kleinste parameter regio van belang. Stel de waarde van het drempeltype in op handmatig of automatisch en sla de wijzigingen op. Bel vervolgens de macro van ImageJ en selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt.Open een afbeelding in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking en selecteer de te meten parameters voor handmatige celvormanalyse. Gebruik het gereedschap keuze uit de vrije hand om de celranden handmatig af te bakenen, zoals aangegeven door de knooppunteiwitten naar keuze. De gekozen parameters worden automatisch berekend voor elke cel.Wanneer alle cellen zijn beschreven, selecteert u bewerken, selecteren en toevoegen aan manager. Alleen volledig zichtbare cellen met ononderbroken randen moeten worden geselecteerd. Als u de meting wilt maken, markeert u alle getallen die in het linkervak van de regio van belangbeheerder worden weergegeven en klikt u op meten.De resultaten worden weergegeven in het vak resultaten en kunnen worden geïmporteerd naar de spreadsheet naar keuze. Geautomatiseerde celanalyse vergemakkelijkt kwantificering van het grote aantal cellen. Voer voor elk nieuw celtype eerst de macro uit om parameters vast te stellen.Wanneer de macro is voltooid, selecteert u celgroottegrenzen instellen. Klik op het label van de kleinste en grootste cellen en klik op meten. Stel de waarde in van de kleinste cel en de grootste celvariabelen en sla de wijzigingen op.Sluit alle macrovensters en selecteer de afbeelding die in grijswaarden moet worden verwerkt. Voer vervolgens de macro opnieuw uit. De macro bevat een tabel met de resultaten die de lijstgegevens van de celvorm, de aspectratio en de gebieden van renteselecties bevat.Hier kunnen representatieve afbeeldingen van brandpuntsverklevingen worden geteld met ImageJ, inclusief de uiteindelijke genummerde contouren en de overlays van de brandpuntshechtingsoverzichten met de oorspronkelijke afbeelding voor zowel de controle- als knockdowncellijnen. Zoals geïllustreerd in deze analyse, de knockdown cellen aangetoond een hoger aantal verklevingen per cel, alsmede verklevingen die groter zijn in omvang in vergelijking met controle cellijncellen. In deze beelden worden representatieve gebieden van onbehandelde en chemotherapeutisch behandelde celmonolagen getoond.De overzichtscellen werden gekenmerkt op basis van hun celvormindexwaarden, bijvoorbeeld in deze analyse die een toename van de laatste opslaglocatie en een afvlakking van de belangrijkste pieken voor de met geneesmiddelen behandelde cellen in vergelijking met onbehandelde controles weergeeft. Een frequentieverdeling en cumulatieve verdeling kunnen dan worden gegenereerd voor elke celcultuur. Grijswaarden beeldvorming van de monolagen zoals aangetoond toegestaan de analyse en kwantificering van 512 cellen uit 12 velden van mening onthullen een relatieve frequentie verdeling van de celvorm index.Om dit protocol te laten werken, is het belangrijk om afbeeldingen van de best mogelijke kwaliteit te gebruiken. Goede celzaaien, vlekken en beeldvorming moeten zorgen voor beelden van voldoende experimentele kwaliteit.

quantification-cell-substrate-adhesion-area-cell-shape-distributions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar lymfeklier (LN) cryosecties. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de tumorcelbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult.

Kwantificering van tumorcelhechting in cryosecties lymfeklieren

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Leer celsubstraatadhesie en celvormindex kwantificeren in MCF7-monolagen met behulp van confocale microscopie en ImageJ-analyse. Deze methode ondersteunt betrouwbaar kankeronderzoek.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Meer video's verkennen