Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Dit protocol maakt kwantificering van het gebied, de omtrek en de vorm van intracellulaire structuur van het tweedimensionale beeld mogelijk. Deze techniek is snel en eenvoudig, vereist alleen standaard laboratoriuminstellingen en een confocale microscoop en maakt gebruik van opensource software. Het aantonen van de procedure zal Anna Balcerak zijn, een promovendus uit mijn laboratorium.

Begin met het zaaien van vier keer 10 tot de vijfde cellen in 0,5 milliliter cultuurmedium per put in een vier-goed collageen een gecoate kamer dia voor een 24-uurs cultuur in een 37 graden Celsius en vijf graden kooldioxide incubator. De volgende ochtend, gebruik maken van een optische omgekeerde microscoop om de aanwezigheid van ten minste 90% confluent monolayer te verifiëren en gebruik een confocale microscoop om enkele Z-slice beelden te verkrijgen. Open de afbeeldingen in ImageJ voor analyse van focale hechtingen en selecteer analyseren, schaal instellen, schaal verwijderen en globaal om de afbeeldingsschaal in pixels in te stellen.

Als u de bestandsnaam en het gebied van het gebied van belang wilt opnemen in de meetopties, klikt u op metingen analyseren en instellen en controleert u het gebied en de weergavelabelopties. Als u de achtergrond wilt aftrekken, selecteert u proces en trekt u de achtergrond af. Stel de rolballenstraal in op 50 pixels en controleer de glijdende paraboloïde.

Als u het gebied van het kleinste interessegebied wilt bepalen, schetst u de kleinste brandpuntshechting en klikt u op analyseren en meten om het gebied te meten. Wanneer ten minste 20 regio's van belang zijn geselecteerd en gemeten, berekent en bewaart u het gemiddelde van de verkregen resultaten. Stel de bovengrens in op 25% van een typisch celgebied.

Als u de afbeelding wilt overleggen aan binair, klikt u op afbeelding, past u deze aan en drempelwaarden en controleert u de standaard-, zwart-wit- en donkere achtergrond. Als u het aantal en de gebieden van de interessegebieden wilt meten, selecteert u deeltjes analyseren en analyseren en pixeleenheden controleren, resultaten weergeven, resultaten wissen en samenvatten. Breng de gegevens van het segment, het aantal en de totale gemiddelde grootte van het gebied over van het overzichtsvenster naar het programma voor gegevensbeheer naar keuze.

Open voor focale adhesie kwantificering de focale adhesie ImageJ macro en betreed het gebied van het kleinste gebied van belang als het gebied van de kleinste parameter regio van belang. Stel de waarde van het drempeltype in op handmatig of automatisch en sla de wijzigingen op. Bel vervolgens de macro van ImageJ en selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt.

Open een afbeelding in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking en selecteer de te meten parameters voor handmatige celvormanalyse. Gebruik het gereedschap keuze uit de vrije hand om de celranden handmatig af te bakenen, zoals aangegeven door de knooppunteiwitten naar keuze. De gekozen parameters worden automatisch berekend voor elke cel.

Wanneer alle cellen zijn beschreven, selecteert u bewerken, selecteren en toevoegen aan manager. Alleen volledig zichtbare cellen met ononderbroken randen moeten worden geselecteerd. Als u de meting wilt maken, markeert u alle getallen die in het linkervak van de regio van belangbeheerder worden weergegeven en klikt u op meten.

De resultaten worden weergegeven in het vak resultaten en kunnen worden geïmporteerd naar de spreadsheet naar keuze. Geautomatiseerde celanalyse vergemakkelijkt kwantificering van het grote aantal cellen. Voer voor elk nieuw celtype eerst de macro uit om parameters vast te stellen.

Wanneer de macro is voltooid, selecteert u celgroottegrenzen instellen. Klik op het label van de kleinste en grootste cellen en klik op meten. Stel de waarde in van de kleinste cel en de grootste celvariabelen en sla de wijzigingen op.

Sluit alle macrovensters en selecteer de afbeelding die in grijswaarden moet worden verwerkt. Voer vervolgens de macro opnieuw uit. De macro bevat een tabel met de resultaten die de lijstgegevens van de celvorm, de aspectratio en de gebieden van renteselecties bevat.

Hier kunnen representatieve afbeeldingen van brandpuntsverklevingen worden geteld met ImageJ, inclusief de uiteindelijke genummerde contouren en de overlays van de brandpuntshechtingsoverzichten met de oorspronkelijke afbeelding voor zowel de controle- als knockdowncellijnen. Zoals geïllustreerd in deze analyse, de knockdown cellen aangetoond een hoger aantal verklevingen per cel, alsmede verklevingen die groter zijn in omvang in vergelijking met controle cellijncellen. In deze beelden worden representatieve gebieden van onbehandelde en chemotherapeutisch behandelde celmonolagen getoond.

De overzichtscellen werden gekenmerkt op basis van hun celvormindexwaarden, bijvoorbeeld in deze analyse die een toename van de laatste opslaglocatie en een afvlakking van de belangrijkste pieken voor de met geneesmiddelen behandelde cellen in vergelijking met onbehandelde controles weergeeft. Een frequentieverdeling en cumulatieve verdeling kunnen dan worden gegenereerd voor elke celcultuur. Grijswaarden beeldvorming van de monolagen zoals aangetoond toegestaan de analyse en kwantificering van 512 cellen uit 12 velden van mening onthullen een relatieve frequentie verdeling van de celvorm index.

Om dit protocol te laten werken, is het belangrijk om afbeeldingen van de best mogelijke kwaliteit te gebruiken. Goede celzaaien, vlekken en beeldvorming moeten zorgen voor beelden van voldoende experimentele kwaliteit.