Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Deze methodologie is belangrijk omdat het een reproduceerbare en nauwkeurige methode mogelijk maakt om topisch aangebrachte geneesmiddelen te kwantificeren met behulp van coherente Raman-beeldvorming. Andere methodologieën bieden omvangrijke cutane farmacokinetische informatie, terwijl deze methodologie zowel bulk- als microschaal cutane farmacokinetische informatie kan bieden, zoals de route van permeatie van een geneesmiddel. De visualisatie- en kwantificerings- en permeatieroutes zullen de ontwikkeling van geneesmiddelen met een specifieke route in gedachten mogelijk maken om de doellocatie te bereiken.

Weefselvoorbereiding zal het meest uitdagende deel van deze methodologie blijken te zijn. Het weefsel moet voldoende dun zijn zodat men door de huid heen kan lezen. Om te beginnen met de voorbereiding van een naakte muis oorhuidweefsel, verwerf geëuthanaseerde naaktmuizen en verwijder de oren van de muis met behulp van een tang en een microchirurgische schaar.

Leg dan één oor in een grote petrischaal van 60 millimeter bij 15 millimeter. Spoel vervolgens het muizenoor twee keer met PBS en dep het oor elke keer droog met de taakwisser. Bij gebruik binnen 24 uur plaatst u het oor in PBS in een kleine petrischaal van 35 millimeter bij 10 millimeter bij twee tot acht graden Celsius.

Om na 24 uur oogsten te gebruiken, plaatst u het oor in een petrischaaltje zonder PBS en bedekt u het gerecht vervolgens met parafilm om in een vriezer bij min 20 graden Celsius te bewaren. Terwijl u onder de biologische motorkap werkt, plaatst u het menselijke huidweefsel in een grote petrischaal met de onderkant van het corneum naar beneden gericht, zodat het onderhuidse vet toegankelijk is. Gebruik dan een tang en een microchirurgische schaar om het onderhuidse vet te verwijderen.

Zodra onderhuids vet niet langer met de schaar kan worden verwijderd, gebruikt u een wegwerp scalpel met 10 messen in een hoek van 45 graden ten opzichte van de huid om het resterende onderhuidse vet te verwijderen terwijl u de huid stilhoudt met een tang. Wanneer het vet wordt verwijderd, verdeelt u de menselijke huid in stukjes van één centimeter bij één centimeter. Voor lipidebeeldvorming plaatst u het voorste deel van het muizenoor naar de glazen bodem van een 35 millimeter, nummer nul schaal.

Plaats voor de menselijke huid de huid met het stratum corneum naar beneden gericht om medicijnkwantificering van de oppervlakkige naar de diepere lagen mogelijk te maken. Zodra het weefsel op de glazen bodem is gecentreerd, gebruikt u een wattenstaafje-applicator om ervoor te zorgen dat de huid plat is en volledig contact heeft met het afdekvlak van de glazen bodemschaal. Om beweging tijdens het beeldvormen te voorkomen, plaatst u een wasmachine op de huid en zorgt u ervoor dat het weefsel zichtbaar is door het middelste gat van de wasmachine voor gestimuleerde Raman-verstrooiing of SRS-transmissiedetectie.

Pipetteer de vooraf bepaalde dosis van de formulering op de huid en gebruik vervolgens een gehandschoende vinger om de formulering gedurende 30 seconden met de klok mee te wrijven. Nadat de toegewezen tijd voor de formulering om door te dringen is verstreken, verwijdert u de overtollige formulering voordat u de huid plaatst met de formuleringszijde naar de glazen bodemschaal gericht. Ga vervolgens verder met de experimentele installatie door de Microscope Control- of MC-software in te schakelen.

Kijk door het oculair en pas de axiale focus aan met de instelknop om ervoor te zorgen dat het weefsel scherp is. Als u klaar bent, deblokkeert u zowel de pomp- als de Stokes-balken en bevestigt u dat ALG1- en ALG2-kanalen zijn ingeschakeld. Zorg ervoor dat de SRS-fotodiode zich boven de condensor bevindt en klik vervolgens op Focus x2 op de MC-software om de skin in de CARS- en SRS-kanalen te visualiseren.

Ga in de module Multi-Area Time Lapse of MATL naar het tabblad Weergave en klik op de lijst met geregistreerde punten om de afbeeldingslijst te laten verschijnen. Zodra het stratum corneum is geïdentificeerd, bladert u door de axiale focus of Z-focus om specifieke weefselstratificaties te identificeren. Specifieke diepten kunnen in de huid worden toegevoegd, zoals stratum corneum, talgklieren, adipocyten of onderhuids vet, zoals bepaald tijdens live beeldvorming met lipidengetuned contrast.

Als echter hele dieptestapels moeten worden genomen, kunnen XY-posities worden toegevoegd en kan de relatieve Z-positie worden genegeerd. In het geval van een beeldspecifieke diepte voor elke huidstratificatie, selecteert u het registratiepunt om het toe te voegen aan de MATL-wachtrij. Voor stapels met volledige diepte klikt u op Punt registreren voor elke XY-positie met diepteselectie in het venster Acquisitieparameters.

Stel vervolgens het aantal herhalingen in op één in de MATL-module en klik op Gereed. Wanneer de afspeelpijl verandert van grijs naar zwart, drukt u op Afspelen om te beginnen met het afbeelden van de voorlopige lipidenstapel. Zodra de beeldvormingscyclus is voltooid, blokkeert u zowel de pomp- als stokes-stralen en wijzigt u de golflengte op de lasergrafische gebruikersinterface in de gewenste golflengte op basis van het beoogde golfgetal of Raman-trilling.

Pas de handmatige tijdvertragingsfase aan en zorg ervoor dat dezelfde krachten worden gebruikt om het lipide en actieve farmaceutische ingrediënt of API in beeld te brengen die a priori zijn vastgesteld. Zodra het totale aantal cyclusherhalingen is gekozen, deblokkeert u de pompstraal en controleert u of het vermogen overeenkomt met het gewenste vermogen met behulp van de fotodiode voordat u op Play drukt om te beginnen met het automatisch afbeelden van de instelpunten. Voer vervolgens gegevensanalyse uit voor elke huidstratificatie door een talgklierlipidenbeeld in Fiji te importeren en het vakje gesplitste kanalen aan te vinken om het bestand te splitsen in de CARS- en SRS-kanalen.

Om de region of interest of ROI Manager te openen, klikt u op Analyze, Tools en ROI Manager. Gebruik het SRS-kanaal zodanig dat C gelijk is aan één, verwijder de selectieknop van de talgklier in de afbeelding en voeg de markeringen toe aan de ROI Manager door te klikken op Add T in de ROI Manager. Herhaal het proces voor elke talgklier in het beeld.

Als u de lipidenrijke gebieden wilt maskeren, selecteert u elke ROI en klikt u vervolgens op de tabbladen Meer, OF Combineren en Toevoegen. Als u de lipidearme gebieden wilt maskeren, gebruikt u het gereedschap Rechthoek in het menu Fiji en tekent u een vierkant rond de hele afbeelding. Voeg de regio toe aan de ROI Manager.

Klik op de nieuw toegevoegde vierkante ROI naast de ROI die alle lipiderijke regio's in de ROI Manager selecteert. Selecteer onder Meer de optie XOR om een masker van de lipidearme regio's te genereren en toe te voegen aan de ROI Manager. Voeg de afbeeldingen in numerieke volgorde samen door naar afbeelding, stapels, gereedschappen en samengevoegde tabbladen in volgorde te gaan.

U kunt de afbeeldingen ook importeren door er een in Fiji te laden en vervolgens een optie te selecteren met de naam Groepsbestanden met vergelijkbare namen op de opstartpagina. Terwijl u de aaneengeschakelde afbeelding actief hebt, gaat u naar de ROI-manager om de lipidenrijke gebieden te selecteren en klikt u op het tabblad Meer voordat u Meerdere metingen selecteert en wacht u vervolgens tot het venster Resultaten verschijnt. Exporteer de gegevens in het venster Resultaten naar een spreadsheet en voeg een kolom met de titel Regio toe om lipidenrijke gebieden toe te voegen aan elke rij met gegevens.

Voeg lipidearm toe aan regio's die buiten de lipiden lagen. Om de gegevens te visualiseren, slaat u de spreadsheet op en importeert u deze in het R-pakket ggplot2. Plot vervolgens de gegevens als een functie van het beeldgetal versus de gemiddelde intensiteit om de concentratie-tijdgegevens te schatten.

Voer niet-compartimentele analyse of NCA uit in RStudio op de intensiteitstijdgegevens die uit de spreadsheet zijn geïmporteerd met de aanroep voor één laag. Als u klaar bent, plot en vergelijkt u Jmax- en AUCflux-all-statistieken. Voer bovendien statistische vergelijkingen uit tussen experimentele omstandigheden.

De representatieve analyse toont stratum corneum, talgklieren, adipocyten, onderhuids vet van de naakte muisoorhuid en stratum corneum, papillaire dermis en een talgklier van de menselijke huid. Bij naakte muisoorhuid werd de beperkte weefselbeweging van talgklieren waargenomen met dezelfde weefseldiepte van de klieren op het moment van formuleringstoepassing en 120 minuten na het aanbrengen. De aanzienlijke weefselbeweging in de huid vertoonde nauwelijks zichtbare talgklieren na 120 minuten toediening van het geneesmiddel, wat de inefficiëntie van het oorspronkelijke protocol aantoont.

In verschillende studies vertoonden de intensiteit versus tijdprofielen hoge aanvangsconcentraties, gevolgd door afnemende concentraties, wat wijst op geen verdere absorptie van het geneesmiddel in het weefsel. Aan de andere kant wezen sommige studies op een stijging van de intensiteiten die later afnamen gedurende de experimentele duur, wat aantoonde dat de flux in het weefsel vóór de beeldvorming geen maximum had bereikt. NCA-analyse van concentratietijdprofielen van twee formuleringen voor dezelfde API gaf aan dat de ethoxy-ethoxyethanol uitgebreide API-permeatie bood in vergelijking met die van de gelformulering, ongeacht de huidlaag.

De totale blootstellingsanalyse tussen dezelfde formuleringen vertoonde vergelijkbare waarnemingen in de diepere lagen van de huid. De voorbereiding van de menselijke huid en de juiste plaatsing van de huid op de glazen bodemschaal na het aanbrengen van het medicijn zijn van cruciaal belang voor het succes van het experiment. De duidelijke oplossingen hier toonden de geschiktheid van deze methodologie aan.

Verder onderzoek zal betrekking hebben op op de markt gebrachte formuleringen zoals crèmes om te begrijpen hoe de formulering api-penetratie en permeatie beïnvloedt.