Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Heterologe expressie van connexinen en innexinen in Xenopus-eicellen is een krachtige benadering voor het analyseren van biofysische eigenschappen van gap junctions. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is het gebruik van een hoge-zijstroommeetmethode die geschikt is voor dubbele spanningsklemmen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Yuan Shui, een postdoctorale fellow uit mijn laboratorium.

Zodra 70 tot 80% van de eicellen zijn ontbladerd, decanteert u de enzymoplossing door de buis voorzichtig te kantelen. Was de eicellen vijf keer door de buis te vullen met ND96-oplossing en vervolgens de oplossing te decanteren. Breng na de laatste wasbeurt de eicellen over in een petrischaaltje van 60 millimeter met ND96-oplossing.

Gebruik een pasteurpipet van schoon glas om grote, gezond uitziende eicellen te plukken en over te brengen naar een petrischaaltje van 60 millimeter met ND96-oplossing aangevuld met natriumpyruvaat en penicilline streptomycine. Bereid een eicelinjectieschaal door een klein stukje nylon gaas op de bodem van een petrischaaltje van 35 millimeter te lijmen. Vul de eicelinjectieschaal ongeveer halverwege met ND96-oplossing aangevuld met pyruvaat en penicilline streptomycine.

Plaats vervolgens 25 tot 30 eicellen in rijen in de petrischaal. Vul een injectie micropipette terug met lichtgewicht minerale olie en steek deze in de micropipettehouder van de injector. Breng het cRNA van een van de opgeslagen aliquots over naar het binnenoppervlak van een petrischaaldeksel of bodem door te pipetteren.

Druk op de vulknop in de injectorcontroller om de cRNA-druppel in de punt van de micropipette te zuigen. Druk vervolgens op de injectieknop om het cRNA te injecteren. Breng de geïnjecteerde eicellen over in een nieuwe petrischaal met ND96-oplossing aangevuld met pyruvaat en penicilline streptomycine.

Bewaar ze één tot drie dagen in de milieukamer bij 15 tot 18 graden Celsius. Vervang de oplossing dagelijks door de eicellen over te brengen naar een nieuwe petrischaal. Gebruik twee fijne pincetten om het transparante villine membraan dat de eicel omwikkelt voorzichtig af te pellen.

Plaats vervolgens twee eicellen per put in een oöcytenparenkamer met de ND96-oplossing. Sluit de differentiële spanningsonde en de stroomkabels aan op de modelcel. Sluit vervolgens de rode en zwarte aansluitingen aan op de differentiële spanningsonde met de meegeleverde jumper en sluit beide poten van de jumper aan op een van beide pinnen in de modelcel.

Sluit de aardingsdraad in de modelcel aan op de kabel via de aardingscircuitaansluiting van de versterker. Draai de VM offset en VE offset knoppen om de membraanspanning en membraanstroommeters op nul te zetten. Schakel de klem uit naar snel of langzaam en draai de versterkingsknop met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt om de spanningselektrode- en badelektrodemeters van de versterker op nul te zetten.

Voer een eenvoudig acquisitieprotocol uit met een paar spanningsstappen om te bevestigen dat de spanning die wordt weergegeven in de membraanspanningsmeter verandert volgens het acquisitieprotocol en dat spannings- en stroomsporen correct worden weergegeven in Clampex. Plaats een petrischaal met de gepaarde eicellen in de petrischaal van het opnameplatform. Selecteer een paar eicellen en draai de petrischaal indien nodig, zodat de twee eicellen in de linker- en rechterrichting staan.

Vergrendel het podium op zijn plaats door de magnetische basis. Plaats een referentie-elektrode in de buurt van de rand van de petrischaal naar de gebruikerszijde. Sluit vervolgens de referentie-elektrode aan op de zwarte aansluiting in slechts één van de twee differentiële spanningsondes.

Neem een paar glazen micropipettes, breek een beetje van de punt af met een diamantscribent en maak de puntrand glad door vuur te polijsten. Houd de micropipette boven de vlam van een alcoholbrander en buig deze in een gladde hoek op ongeveer een centimeter afstand van de punt. Vul de glazen pipet volledig terug met ND96-oplossing en plaats deze vervolgens in een voorgevulde micro-elektrodehouder.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Steek de twee millimeter pin van de micro-elektrodehouder in de twee millimeter socket van een differentiële spanning elektrode aansluitdraad. Klem de twee millimeter socket op een magnetisch gebaseerde klem en richt de punt van de differentiële spanningselektrode op een van de twee eicellen.

Steek de één millimeter pin van de differentiële spanning elektrode aansluitdraad in de rode aansluiting van de differentiële spanningsonde aan dezelfde kant. Bereid de spannings- en stroomelektroden van de glazen haarvaten voor en vul ze terug met kaliumchlorideoplossing. Plaats vervolgens de elektroden in de elektrodehouders die bij de versterkers zijn geleverd.

Laat de elektroden in de badoplossing zakken en draai de VM offset- en VE-offsetknoppen naar nul van de membraanspanning en membraanstroommeters. Controleer de elektrodeweerstand door op VM-elektrodetest en VE-elektrodetest te drukken. Plaats de stroom- en spanningselektroden in de eicellen en observeer de negatieve membraanpotentialen.

Bevestig vervolgens in het klemgedeelte van de versterker dat dc-versterking zich in de in-positie bevindt. Draai de versterkingsknop met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt en draai de klemschakelaar van uit naar snel. Voer ten slotte een acquisitieprotocol uit.

Een diagram van het eicelexperiment wordt hier getoond. Negatieve en positieve membraanspanningsstappen worden toegepast op eicel 1 van een houdmembraanspanning van minus 30 millivolt, terwijl eicel 2 wordt gehouden bij een constante membraanspanning van minus 30 millivolt. De trans-junctionele spanning, of Vj, wordt gedefinieerd als de membraanspanning van eicel 2 minus de membraanspanning van eicel 1.

De representatieve afbeeldingen tonen de monster Lj-sporen en de resulterende genormaliseerde junctionele geleiding trans-junctionele spanningsrelatie van UNC-9 homotypische gap junctions. Sample Lj sporen en de resulterende genormaliseerde Gj-Vj relatie van UNC-7b homotypische gap junctions worden hier getoond. De resultaten tonen aan dat deze twee soorten Gjs verschillen in de Vj-afhankelijke Ij-inactivatiesnelheid, Vj-afhankelijkheid en de hoeveelheid resterende Gj.Tijdens het proberen van de procedure is het erg belangrijk om ervoor te zorgen dat het differentiële spanningselektrodesysteem geen luchtbellen heeft en dat de tip zeer dicht bij de eicel is gericht en de spannings- en stroomelektroden een weerstand van ongeveer één microohm hebben.

Onze techniek is eenvoudig te implementeren. Het kan van bijzonder belang zijn voor die laboratoria die nieuw geïnteresseerd zijn in het gebruik van Xenopus-eicellen om gap junctions te bestuderen.