Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

De mechanismen van eiwitaggregatie zijn tot nu toe voornamelijk in vitro onderzocht. Met ons protocol kunnen we vergelijkbare kwantitatieve studies doen in het modelorganisme C.elegans. Het grote voordeel van onze methode is de onbevooroordeelde kwantificering van inclusiegetallen.

En door deze hoogwaardige gegevens aan te passen aan wiskundige modellen, kunnen we inzicht krijgen in het aggregatiemechanisme. Eiwitaggregatie komt voor bij veel ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ZvH. Het begrijpen van het moleculaire mechanisme van eiwitaggregatie in vivo is cruciaal om nieuwe therapieën te ontwikkelen.

Begin met het plaatsen van 10 volwassen nematoden op een 6 cm gezaaide NGM-plaat met een platina wormenpluk om een gesynchroniseerde eierlegging uit te voeren. Laat de volwassenen ongeveer twee uur eieren leggen bij 20 C voordat ze van het bord worden verwijderd. Plaats de borden met eieren in de broedmachine bij 20 C.Monitor de ontwikkeling van de dieren totdat ze volwassen zijn op ongeveer de derde dag na de leg.

Bereid de 384-putplaat voor door het vereiste aantal putten te vullen met 100 L M9-buffer aangevuld met 25 mM natriumazide als verdovingsmiddel. Vul één put per soort om in beeld te brengen. Breng voor elke stam 20 dieren over in één put met behulp van een platina wormenprik.

Bedek de plaat met het deksel tot preventieve verdamping en breng de plaat binnen een uur na bereiding in beeld. Schakel het instrument in en open de software. Klik op de afspeelknop naast Putplaten lossen en plaats de 384-putplaat in de microscoop.

Klik onder Actielijst en 3D-fluorescentie-acquisitie op Testen en selecteer de bron met wormen. Stel Beeldverwerking in op Geen. En klik op de play-knop om de optimale schakelafstand te bepalen waarop de wormen correct zijn gecentreerd.

Stel Ascending Distance in op 50 m, Descending Distance op 50 m en Slicing Interval op 2 m om de volledige dikte van de dieren in de z-stack vast te leggen. Stel Beeldverwerking terug op Maximum. Selecteer de putjes die moeten worden afgebeeld onder Well Plate Scan Setting.

En selecteer vervolgens Tegel en Verkrijg hele put. Sla de meetinstelling op. En klik op Meting starten om het experiment te starten.

Open CellProfiler en sleep de pijplijn naar het venster Een pijplijnbestand hier neerzetten. Klik op Ja om het project te laden. Sleep vervolgens de gestikte afbeeldingen naar het venster Bestanden neerzetten en map hier.

Klik op de metadata-invoermodule. Pas de reguliere expressie aan om uit de bestandsnaam te extraheren op basis van de namen van de samengevoegde afbeeldingen. Klik op de invoermodule NamesAndTypes en pas de regelcriteria selecteren aan zodat deze overeenkomen met de kanalen in de bestandsnamen.

Klik vervolgens op Uitvoerinstellingen om een map te selecteren om de uitvoer van CellProfiler op te slaan. Klik op Testmodus starten om de instellingen van de pijplijn te controleren met behulp van de eerste beeldgegevensset. Klik op Stap om de pijplijn te doorlopen, module voor module.

Als u de contouren van de worm wilt aanpassen, klikt u op Help weergeven in de module EditObjectsManually om de instructies weer te geven. Corrigeer de contouren. En klik vervolgens op Gereed om door te gaan met het uitvoeren van de pijplijn.

Klik op Testmodus afsluiten en Afbeeldingen analyseren. Open de uitvoermap om de uitvoerbestanden te bekijken. En open de afbeeldingen met de oorspronkelijke bestandsnaam gevolgd door contouren om te controleren of de wormen en insluitsels correct over elkaar zijn gelegd.

Om AmyloFit te gaan gebruiken, geeft u het project een naam en klikt u op Project maken. Klik op Openen om het te openen. En maak een sessie door deze een naam te geven en op Sessie maken en laden te klikken.

Klik op Gegevens toevoegen en upload het bestand met het gemiddelde aantal insluitsels per dier, volgens de vereisten voor gegevensindeling die in het linkerdeelvenster worden weergegeven. Klik vervolgens op Nieuwe gegevens laden. Stel Aantal punten op gemiddelde over voor nulpuntsverschuiving in op 0 en stel Aantal punten op gemiddeld voor plateau in op 0 om de voorbewerkingsstappen over te slaan, die niet vereist zijn voor gegevens over het aantal inclusies.

Klik vervolgens op Verzenden. Herhaal deze stap voor elke eiwitconcentratie. Selecteer Aangepast in het deelvenster Model.

Voer de vergelijking voor onafhankelijke nucleatie in het vak Vergelijking in. En klik op Model laden. Stel voor Ncells het parametertype in op Globale constante en stel Waarde in op 95, wat overeenkomt met het aantal lichaamswandspiercellen.

Stel de parametertypen in op Globaal geschikt voor Kcell en n. En naar Constant voor m. Voer de waarden van m in voor de verschillende stammen in het linkerdeelvenster.

Laat het aantal bassinhopen ongewijzigd en klik op Passen in het deelvenster Aanmeten. Pak ten slotte de pasvorm uit door op Gegevens downloaden en aanpassen te klikken. De inclusiegetallen werden gemonitord in vier C.elegans-stammen die verschillende Q40-concentraties tot expressie brachten.

Het onafhankelijke nucleatiemodel beschrijft de aggregatiekinetiek goed. De fit leverde een reactievolgorde op van 2,1 en een nucleatiesnelheid van 0,38 moleculen per dag per cel bij een intracellulaire eiwitconcentratie van 1 mM. Twee onafhankelijke biologische replicaties in een eerdere studie toonden nauw overeenkomende waarden voor de reactievolgorde en nucleatiesnelheid.

Een ding dat in gedachten moet worden gehouden, is dat u hoogwaardige datasets nodig hebt voor meerdere eiwitconcentraties om betrouwbare pasvormen te verkrijgen. Deze methode kan worden gebruikt om manieren te vinden om te interfereren met eiwitaggregatie in een levend organisme, zoals genetische knockdowns of behandelingen met kleine moleculen.