Experimentele en data-analyse workflow voor soft matter nano-indentatie

Dit protocol toont een stapsgewijze handleiding om de stijfheid van hydrogels en cellen te meten met behulp van een in de handel verkrijgbare nano-indenter en presenteert ook een open-source software om verkregen gegevens reproduceerbaar te analyseren. Het protocol stelt ons echter in staat om atoomkrachtmicroscopie-achtige gegevens te verkrijgen, op een fractie van de complexiteit. Dus dit protocol zal nuttig zijn voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van mechanische eigenschappen van gezonde en zieke monsters, maar we geloven ook dat het van bredere toepasbaarheid zal zijn in de context van nano-indentatie voor zachte materialen.

Nadat u het instrument hebt ingeschakeld en de geselecteerde sonde voor het experiment hebt gemonteerd, begint u met het kalibreren van de sonde. Klik op Initialiseren in het hoofdvenster van de software. Voer in het kalibratiemenu dat wordt weergegeven de testgegevens in de invoervakken in.

Vul vervolgens een dikke, glazen petrischaal met een platte bodem met hetzelfde medium als de monsterschaal en stem de temperatuur van het medium af op die van het monster. Plaats vervolgens de kalibratieschaal onder de sonde. Voor kalibratie in vloeistof, bevochtigt u de sonde met een druppel van 70% ethanol of isopropanol met het uiteinde van de pipet in licht contact met de glazen ferrule, zodat de druppel over de cantilever en bolvormige punt glijdt.

Schuif vervolgens handmatig de arm van de nano-indenter naar beneden totdat de sonde volledig is ondergedompeld, maar nog steeds ver weg van de bodem van de petrischaal. Wacht vijf minuten om evenwichtscondities in de vloeistof te bereiken. Klik vervolgens in het initialize-menu van de software op Scan Wavelength.

Het scherm van de interferometer toont een voortgangsbalk. Controleer of de optische scan is geslaagd door naar het deelvenster Golflengtescan op het vak interferometer te gaan. Klik vervolgens in het menu Initialiseren op Surface zoeken om de sonde geleidelijk te verlagen.

De sonde stopt met bewegen wanneer deze contact maakt met de glazen petrischaal. Zodra de sonde in contact staat met het oppervlak, beweegt u de sonde een micrometer naar beneden met behulp van de pijlknop naar beneden in het hoofdvenster van de software. Observeer het groene signaal in het live-venster voor wijzigingen in de basislijn bij elke stap van één micrometer.

Klik vervolgens op Kalibreren in het menu Initialiseren. Wanneer de kalibratie is voltooid, controleert u de oude en nieuwe kalibratiefactoren in het weergegeven pop-upvenster. Als de nieuwe kalibratiefactor zich in het juiste bereik bevindt, zoals uitgelegd in het manuscript, klikt u op Nieuwe factor gebruiken.

Verhoog vervolgens de piëzo met 500 micrometer. Controleer vervolgens of de demodulatiecirkel correct is gekalibreerd door naar het tabblad Demodulatie op het bureaublad van de interferometer te gaan. Tik zachtjes op de optische tafel of de nano-indenter om voldoende ruis op te wekken.

Een witte cirkel van discrete gegevenspunten moet ongeveer de rode cirkel bedekken. Laad de petrischaal met het monster op het microscoopstadium en verplaats de sonde van de nano-indenter handmatig naar een gewenste positie boven het monster. Schuif de sonde in oplossing en zorg ervoor dat er één tot twee millimeter tussen de sonde en het oppervlak van het monster blijft.

Wacht vijf minuten totdat de sonde in oplossing in evenwicht is. Focus op de sonde met de optische microscoop. Om de young's modulus van zachte materialen te meten, klikt u op Experiment configureren.

Voeg een Surface-stap zoeken en een enkele inspringing in verplaatsingsbesturingselement toe om experimentele parameters te bepalen die vervolgens worden gebruikt voor de automatische matrixscan. Als de enkele inkeping succesvol is, configureert u een matrixscan met 50 tot 100 punten met een onderlinge afstand van 10 tot 100 micrometer. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het vakje Oppervlak automatisch zoeken is aangevinkt, klikt u op Werkgebiedpositie gebruiken om de matrixscan te starten vanaf de huidige fasepositie.

Stel het matrixscanprofiel in verplaatsingsbeheer in. Laat het aantal segmenten op vijf staan en gebruik het standaard verplaatsingsprofiel. Wijzig indien nodig het verplaatsingsprofiel en de tijd voor elk hellend segment.

Overschrijd de reksnelheden van meer dan 10 micrometer per seconde niet. Sla het geconfigureerde experiment op in het gewenste experimentpad. Klik op Experiment uitvoeren en wacht tot het is voltooid.

Wanneer alle gegevens zijn verkregen, reinigt u de sonde en schakelt u het instrument uit zoals beschreven in de tekst. Voor het screenen van krachtverplaatsingscurves en de productie van opgeschoonde dataset in JSON-formaat, startvoorbereiding. py vanaf de opdrachtregel op de labcomputer.

Selecteer de Optics11-gegevensindeling in de vervolgkeuzelijst. Als de gegevens niet correct zijn geladen, start u de grafische gebruikersinterface opnieuw en selecteert u Optics11 Old. Klik vervolgens op Map laden en selecteer een map met de te analyseren gegevens.

Reinig de dataset met behulp van de tabbladen aan de rechterkant van de grafische gebruikersinterface. Klik vervolgens op JSON opslaan en voer een geschikte naam in voor de opgeschoonde gegevensset. Stuur het JSON-bestand naar de computer waarop de NanoAnalysis-software is geïnstalleerd, indien verschillend van de huidige computer.

Start de nano. py-bestand vanaf de opdrachtregel. Klik linksboven in de grafische gebruikersinterface op Load Experiment en selecteer het JSON-bestand.

Hiermee worden de bestandslijst en de grafiek met onbewerkte curven gevuld met de gegevensset in termen van krachtverplaatsingscurven. Vink in het vak Statistieken de waarden aan van de drie parameters, N geactiveerd, N mislukt en N uitgesloten. Om een specifieke curve in meer detail te visualiseren, klikt u op de curve.

Dit markeert het in het groen en toont het op de huidige curvegrafiek. Zodra een enkele curve is geselecteerd, worden de R- en k-parameters ingevuld in het vak Statistieken. Zodra de gegevensset verder is opgeschoond, filtert u alle ruis in de curven met behulp van de filters die zijn geïmplementeerd in het vak Filteren.

Controleer vervolgens de gefilterde curven in de huidige curvegrafiek. De gefilterde curve is in zwart, terwijl de niet-gefilterde versie groen is. Als u het contactpunt wilt vinden, kiest u in het vak Contactpunt een van een reeks numerieke procedures die in de software zijn geïmplementeerd.

Pas de parameters van het algoritme aan de dataset aan, zodat het contactpunt correct is gelokaliseerd, zoals uitgelegd in het manuscript. Als u wilt zien waar het contactpunt op een enkele curve is gevonden, selecteert u de curve door erop te klikken. Klik vervolgens op Inspecteren.

Controleer het pop-upvenster dat verschijnt om te identificeren waar het contactpunt zich bevindt. Klik vervolgens op Hertz Analyse. Dit levert drie grafieken op.

Controleer de krachtinspringingsgegevens voor elke curve in de gegevensset, samen met de gemiddelde Hertz-fit die in rood wordt weergegeven. Controleer vervolgens de gemiddelde krachtinspringingscurve met een foutband die één standaarddeviatie weergeeft, samen met de gemiddelde Hertz-pasvorm die in rood wordt weergegeven. Controleer vervolgens de scatter plot van de Young's modulus afkomstig van het passen van het Hertz-model aan elke individuele curve.

Controleer het vak Resultaten op de modulus van het berekende gemiddelde Young en de standaarddeviatie en zorg ervoor dat deze redelijk zijn voor het gegeven experiment. Klik vervolgens in het vak Opslaan op Hertz. Voer in het pop-upvenster de bestandsnaam en map in en klik op Opslaan.

Er wordt een tsv-bestand gemaakt. Open het tsv-bestand in aanvullende software voor statistische analyse en verdere plotting. Voor cel nano-indentatiegegevens klikt u op Elasticity Spectra Analysis.

Inspecteer de twee geproduceerde plots, namelijk Young's modulus als functie van de inkepingsdiepte voor elke curve en de gemiddelde Young's modulus als functie van inkepingen gemonteerd door een dubbellaags model. Zodra de analyse is voltooid, klikt u op ES in het vak Opslaan. Hiermee exporteert u een tsv-bestand in de opgegeven map, dat kan worden geopend en uitgezet in elke andere software naar keuze.

Een succesvol experiment resulteert in het benaderingssegment van een krachtverplaatsingscurve, met een duidelijke, vlakke basislijn, een overgangsgebied en een hellend gebied. Curven die wijzigingen van deze vorm laten zien, kunnen eenvoudig uit de gegevensset worden verwijderd met NanoPrepare. Gemiddelde kracht-inkepingscurven samen met het gemiddelde Hertz-model voor een zachte polyacrylamidehydrogel en een stijve hydrogel worden hier weergegeven.

Door individuele waarden van de Young's modulus uit te zetten, werd de verwachte gemiddelde Young's modulus voor beide hydrogels opgehaald. Voor celnano-indentatie-experimenten tonen de gemiddelde kracht-indentatiecurve en het bijbehorende gemiddelde Hertz-model aan dat het Hertz-model de evolutie van kracht met toenemende inkepingsdiepte voor celnano-indentatie-experimenten niet volledig vastlegt. De gemiddelde elasticiteitsspectra tot een inkeping van 200 nanometer worden hier gedemonstreerd.

De gemiddelde elasticiteitsspectra beginnen toe te nemen bij een inkepingsdiepte van 200 nanometer, wat de bijdrage van een substraat aan de onderzochte schijnbare Young-modulus aangeeft. Daarom werd gekozen voor 200 nanometer als passend bereik voor zowel het Hertz- als het bilayer-model. Door het bilayer-model aan te passen, kan het extract meer informatie krijgen over de mechanische toestand van de cel, inclusief de dikte van de celactine cortex, de celactine cortex modulus en de celmassamodulus, zoals uitgelegd in de hoofdtekst.

Een directe vergelijking tussen het Hertz-model en de elasticiteitsspectrabenadering in termen van Young's modulusverdeling onthult overlappende verdelingen met vergelijkbare middelen, wat de haalbaarheid van de elasticiteitsspectrabenadering aantoont. Het nauwkeurig lokaliseren van het contactpunt en het consistent houden van de gekozen algoritmeparameters tussen datasets die men wil vergelijken, is van het grootste belang voor het verkrijgen van betrouwbare vergelijkingen tussen steekproeven. De methode is algemeen toepasbaar om de lokale elastische eigenschappen van biologische monsters te kwantificeren, waaronder sferoïden, organoïden, weefsels en in het algemeen alle zachte materie.