Analyse van de interactie van fluorescerende gelabelde eiwitten met kunstmatige fosfolipide microvesicles met behulp van kwantitatieve flowcytometrie

Met behulp van deze hoeveelheidsstroomcytometriemethode kunnen onderzoekers de kinetische en evenwichtsgebruiken van ingebrachte membraaninteractie berekenen en het aantal eiwitten schatten dat wordt binnengebracht door locaties op het PPH-membraan. De voordelen van deze methode zijn de eenvoud en beschikbaarheid van reagentia en apparatuur. Deze methode is uitsluitend bedoeld voor fundamenteel onderzoek.

Het protocol is ontwikkeld om eiwitlipide-interacties in bloedberekening te bestuderen en kan op andere gebieden worden gebruikt om de interactie van eiwitten met verschillende lipidemembranen te karakteriseren. De methode kan worden gebruikt voor de kwantiteitsbeoordeling van ligandbindingsdynamica op de verschillende cellen en ligandtypen. Start de kinetische bindingsexperimenten door fosfolipide blaasjes in de buffer van Tyrode te verdunnen tot een concentratie van één micromolair en een totaal volume van 250 microliter.

Meng vervolgens fluorescerende gelabelde stollingsfactor X of FX FD en een concentratie van 500 nanomolair met de fosfolipide blaasjes in een één-op-één verhouding om een totaal volume van 500 microliter te krijgen. Injecteer onmiddellijk 500 microliter van de gemengde suspensie in de flowcytometer. Bij een stroomsnelheid met een excitatiegolflengte van 488 nanometer en een emissiefilter van 585 nanometer;met een breedte van 42 voor kanaal FL twee.

Meet vervolgens de gemiddelde fluorescentie in kanaal FL vier met excitatie op 633 nanometer en emissiefilter op 660 nanometer met een breedte van 20. Wanneer de verzadiging van de binding is bereikt, verdunt het monster snel 20-voudig met de buffer van Tyrode en controleert u de dissociatie totdat een basisvloeiingsfluorescentie of een plateau is bereikt. Voor evenwichtsbindingsexperimenten incubeer vijf micromolaire kunstmatige fosfolipide blaasjes met variërende concentraties FX FD van nul tot 1000 nanomolaar in de buffer van Tyrode gedurende 20 minuten.

Verdun na incubatie elk monster met een factor 20 tot een laatste volume van 200 microliter met de buffer van Tyrode en analyseer vervolgens het verdunde monster binnen 30 seconden door flowcytometrie. Om de gegevens te analyseren, exporteert u de experimenten in FSC-formaat van cytometriegegevensacquisitiesoftware naar cytometersoftware voor gegevensanalyse. Door het bestand te kiezen en vervolgens op de tabbladen export- en FSC-bestanden te klikken.

als u klaar bent, opent u de FCS-bestanden in cytometersoftware door de bestanden op de computer te selecteren en de bestanden naar de werkruimte van het programma te slepen. Voor het gating van de microvesicles, identificeer het gebied van microvesicles door fluorescentie van de lipofiele kleurstof, DIC 16 drie. Gebruik vervolgens de plotknop in het werkblad om een dot plot SSC te maken van FL twee D I C 16 in logcoördinaten.

Kies vervolgens de rechthoekige poortknop om een gatgebied te tekenen. Om de kinetische experimenten te analyseren, maakt u een dot plot met behulp van de coördinaten van fluorescentie over de tijd voor het gebied van de blaasjes. Exporteer vervolgens de gegevens over de verandering in fluorescentie in de loop van de tijd in het CSV-formaat; door een voorbeeld te kiezen en met de rechtermuisknop op het exporttabblad te klikken, gevolgd door fl vier keer in parameters te kiezen, de map te selecteren om op te slaan voordat u op het geselecteerde CSV-formaat klikt en op het tabblad exporteren klikt.

Open na overdracht het CSV-bestand in statistische software om de eenvoudige voortschrijdende gemiddelde fluorescentie en tijd voor elke 1000 gebeurtenissen te berekenen, benadert een grafiek van de afhankelijkheid van de enkele voortschrijdende gemiddelde fluorescentie op tijd onder de aanname van exponentiële afhankelijkheid en gebruik de waarde om de kinetische associatieconstante te berekenen met behulp van een vergelijking. Bereken vervolgens de kinetische dissociatieconstante met behulp van de vergelijking zoals eerder beschreven. Om de datum van de evenwichtsbindingstest te analyseren, bepaalt u de gemiddelde fluorescentie van FX FD in het gebied van de blaasjes voor elke geselecteerde concentratie FX FD en benadert u vervolgens de afhankelijkheid van de gebonden factorfluorescentie van de concentratie van de toegevoegde factor in de aanname van binding op één plaats.

Bereken de gemiddelde bindingsparameters met behulp van een vergelijking van minimaal drie onafhankelijke herhalingen. Ga verder met het bereiden van gekalibreerde kralen door gel gefilterde bloedplaatjes te incuberen met calcium IANA 4A drieëntwintig, honderdzevenentachtig in aanwezigheid van 2,5 millimolair calciumchloride gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de geactiveerde bloedplaatjes de verschillende concentraties FX FD toe en incubeer de bloedplaatjes met twee volumeprocent formaldehyde.

Stop na een uur de reactie door de bloedplaatjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met drie molaire glycine en 5% BSA. Zuiver vervolgens het mengsel van de niet-gereageerde kleurstof met centrifugatie op 400 maal G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernate voordat u de pellet resuspendeert in de buffer van Tyrode met 0,5% BSA.

Meet vervolgens het fluorescentieniveau van de kalibratieparels in elk monster met behulp van een spectrofluorometer en vervolgens met behulp van de flowcytometer. Bepaal het aantal kralen in elk monster met behulp van een celteller. Converteer de fluorescentie-intensiteit van elk respectievelijk kraalmonster naar de concentratie oplosbare fluorescerende kleurstof met behulp van een spectrofluorometer en herbereken de fluorescentiekleurstofconcentratie voor het aantal spectrofluorometermoleculen.

Maak een afhankelijkheidsgrafiek van de gemiddelde fluorescentie van de kralen in een flowcytometer op het aantal flurofore-moleculen voor elk monster. Benader vervolgens de afhankelijkheid door lijnproportionaliteit met behulp van de analyse die lineaire tabbladen in volgorde past en past. Bereken op basis van de benadering in de vergelijking de conversiefactor van de gemiddelde fluorescentie naar bindingsplaatsen.

Bereken later het schijnbare aantal bindingsplaatsen per vesikel van belang. De representatieve analyse toont gating van de kunstmatige fosforlipideblaasjes die één micrometer groot zijn met de opgenomen lipofiele fluorescerende kleurstof, kleurstof I C 16, de poort werd ingesteld op basis van een monster met dezelfde grootte kunstmatige lipideblaasjes zonder de fluorescerende kleurstof. De kinetiek van het eiwit dat zich aan de blaasjes bindt, werd in de eerste fase geanalyseerd door het monster continu te verzamelen.

De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De flowcytometrische metingen moeten zo snel mogelijk beginnen na het mengen van de oplossingen en het verdunnen met de buffer van Tyrode. De voorgestelde methode kan worden aangevuld met oppervlakteplasmaresonantie voor het bestuderen van ingebrachte membraaninteracties die zeer gevoelig zijn met een goede tijdelijke resolutie en geen levering vereisen Het belangrijkste voordeel van deze methode is de toegankelijkheid en eenvoud.