Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Het protocol presenteert verschillende microscopietechnieken die worden toegepast om de schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe planten te begrijpen, van het verzamelen tot het voorbereiden van monsters in detail en omvatten essentiële stappen. Dergelijke technieken kunnen worden toegepast op verschillende mycoheterotrofe planten en zelfs op andere materialen van een plant dan mycoheterotrofen. Deze methode is voornamelijk gerelateerd aan structurele plantkunde en zou ook inzicht kunnen geven in mycorrhiza-interacties, fysiologie, reproductieve biologie, evolutie en ecologie van mycoheterotrofe planten.

Verzamel om te beginnen de mycoheterotrofe planten door de grond rond de plantenbasis te verkennen en ervoor te zorgen dat de ondergrondse organen niet worden beschadigd. Vermijd ook om de planten van de grond te trekken om te voorkomen dat de luchtorganen worden losgekoppeld van de ondergrondse organen. Graaf zorgvuldig rond luchtstructuren met behulp van een tuintroffel terwijl u de ondergrondse organen zoals wortels, stengels, wortelstokken en opslagorganen verkent zonder deze structuren te beschadigen.

Verwijder bodemdeeltjes om fragiele structuren te behouden en was deze organen voorzichtig met kraanwater om de resterende bodemdeeltjes af te spoelen voordat de monsters worden bevestigd. Mycoheterotrofe planten geassocieerd met bladafval vragen extra aandacht. Verzamel daarom zorgvuldig de delicate organen die verbonden zijn met het ontbindende materiaal via hun schimmeldraden zonder ze uit de verbonden structuren te trekken.

Behoud structuren met dergelijke verbindingen en verzamel het strooisel voor analyse. Voor transmissie-elektronenmicroscopieanalyse snijdt u de 3 tot 4 millimeter dikke monsters in een druppel glutaaraldehydenatrocodylaatbuffer in kleinere secties van 1 tot 2 millimeter dikte. Gooi de snijranden buiten de druppel weg.

Zorg ervoor dat het fixatieproces onmiddellijk na het verzamelen van planten op de verzamelplaats wordt uitgevoerd. Breng de secties onmiddellijk over naar een verzamelbuis met een volume fixatief dat meer dan 10 keer groter is dan het volume van de monsters, omdat het een additief fixatief is. Voor oppervlakteanalyse van de oppervlakkige schimmeldraden in de organen, vooral in ondergrondse en die in contact met bladafval.

Observeer vers of vast materiaal onder de ontleedmicroscoop bij een vergroting van 7,5x of hoger. Zoek naar de interessegebieden geleid door de oppervlakkige schimmeldraden en de rhizomorfen. Selecteer de monsters die gebieden van oppervlakkige rhizomorfen bevatten, omdat deze kunnen worden doorsneden om pelotonen en schimmeldradenspoelen in corticale cellen in wortels en stengels te visualiseren.

Bereid 0,2 milligram per milliliter tarwekiem agglutinine fluorochroomconjugaat en 1% calcofluor witte oplossingen in 0,1 molaire fosfaatbuffer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Incubeer nu de secties op glazen dia's door ze gedurende 30 minuten goed te bedekken met tarwekiem agglutinine fluorochroom geconjugeerde oplossing. Was na de incubatie de secties met 0,1 molaire fosfaatbuffer en incubeer ze in de calcofluoroplossing als een montagemedium.

Plaats vervolgens de afdekglijders op de dia's en observeer deze onder een confocale of fluorescentielichtmicroscoop met behulp van de aangegeven filters. Na het bevestigen van de monsters, het uitvoeren van uitdroging en het opslaan in 70% ethanol, stelt u elk gewenst oppervlak bloot voor scanning elektronenmicroscopieanalyse door een scherp en nieuw scheermesje te gebruiken om sneden te maken met een eenrichtingsbeweging. Gebruik indien nodig een stereomicroscoop om de monsters te selecteren en rekening te houden met het gebied met metalen stompen bij het bepalen van de steekproefgroottes.

Droog verder de monsters uit in een ethanolische reeks. Houd kleine en delicate monsters gedurende 30 minuten in elke concentratie en grotere en dichtere monsters gedurende 1 uur. Vouw vervolgens kleine enveloppen met tissuepapier om monsters te ordenen voor de volgende stappen.

Grotere monsters kunnen zonder envelop worden behandeld. Label de enveloppen met een potlood en houd een logboek bij van de monsters. Plaats de monsters voorzichtig in de enveloppen met behulp van een penseel.

Bewaar deze monsters nu in absolute ethanol. Ga onmiddellijk over tot het drogen van kritieke punten door een kritische puntdroger te gebruiken volgens de standaard bedrijfsprocedures. Plaats hiervoor de monsters in absolute ethanol in een monsterhouder en plaats deze in de drukkamer van de kritische puntdroger.

De tussenvloeistof lost op in de overgangsvloeistof op het kritieke koolstofdioxidepunt, waardoor de monsters drogen. Omdat reabsorptie van de luchtvochtigheid de monsters kan vernietigen, bewaart u ze onmiddellijk na het drogen van het kritieke punt in een droogmiddel. Voordat u de monsters op metalen stronken monteert, trekt u de handschoenen aan om de stompen te manipuleren.

Dompel ze 5 minuten onder in aceton om vet te verwijderen en laat ze drogen. Bevestig de monsters onder een stereomicroscoop op de stomp met behulp van een geleidende dubbelzijdige koolstofklevende tape en plaats ze. De site van bovenaf is het enige mogelijke perspectief in scanning elektronenmicroscopie beelden.

Om de monsters te manipuleren, gebruikt u een fijnpunt pincet. Het monsterdeel dat door het pincet wordt aangeraakt, is meestal beschadigd. Wees dus voorzichtig en probeer onderdelen aan te raken die uit de buurt van de interessegebieden zijn geplaatst.

Onderhoud de stompen met monsters in een afgesloten petrischaal met silicagel. Ga vervolgens verder met sputtercoating om een laag goud of platina op het oppervlak van de monsters af te zetten in een lagedrukatmosfeer van inert gas door de standaard operationele procedures te volgen. De laagdikte is afhankelijk van de topografie van het monster en ligt meestal tussen de 15 en 40 nanometer.

Tot slot, onderhoud de gecoate stompen in een afgesloten petrischaal met silicagel die vocht vasthoudt. De monsters kunnen op deze manier wekenlang worden bewaard. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop om deze monsters te analyseren.

Een elektronenbundel raakt het in vacuo-monster tijdens scanning-elektronenmicroscopie en de signaalemissie van een dergelijke interactie wordt geïnterpreteerd als afbeeldingen. Zorg ervoor dat de oplossingen en materialen die worden gebruikt bij de symbiotische kieming van zaden steriel zijn. om besmetting te voorkomen.

Begin met ze 20 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius. Desinfecteer in een laminaire luchtstroomkap oppervlakkig de vruchten en zaden door ze onder te dompelen in een natriumhypochlorietoplossing die 2% actief chloor bevat. Slanke en fragiele zaden kunnen worden ondergedompeld in een 1:1 verdunde natriumhypochlorietoplossing.

Herstel na desinfectie de zaden door ze te filteren met xerografische stof. Was de vruchten en zaden driemaal in gedestilleerd geautoclaveerd water om de hypochlorietoplossing te verwijderen voordat u doorgaat met de kiemingstests. Bewaar ze indien nodig in filterpapieren enveloppen in glazen kolven met silicagel bij 4 graden Celsius en sluit de kolven hermetisch af en sluit ze af met vershoudfolie, en evalueer vervolgens de effectiviteit van het wasproces door enkele druppels water van de laatste was over te brengen naar aardappel dextrose agar.

Voor symbiotische ontkieming van orchideeënzaden, incubeer de zaden over 1 tot 2 centimeter geautoclaveerde filterpapierschijven die in petrischalen met havermout-agarcultuurmedium zijn geplaatst. Ent nu het midden van de petrischaal met het fragment van het kweekmedium dat mycelium bevat van de gekozen geïsoleerde schimmel. Sluit de petrischalen af met vershoudfolie en incubeer ze in het donker bij ongeveer 25 graden Celsius of kamertemperatuur, afhankelijk van de schimmelgroei.

Bereid sommige gerechten met zaden en zonder schimmelinenting als een negatieve controle voor de kiemtest. Analyseer de kiemresultaten wekelijks door kwantitatieve en kwalitatieve gegevens te verzamelen en protocormen en zaailingen te fotograferen. De rhizomorfen zijn gemakkelijk te herkennen, meestal als donkere, schoenachtige structuren.

Uit de vrije hand of andere methoden om secties dikker dan 10 micrometer te verkrijgen, kunnen pelotons beter uitbeelden en meer representatieve beelden van schimmelpatronen van kolonisatie bieden. Secties uit de vrije hand kunnen ook geschikt zijn voor schimmeldradenanalyse bij hogere versterking. Hoewel, details worden beter bereikt in dunnere secties.

De secundaire celwanden in xyleemelementen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door de lichte kleur die toluidine verwerft. Ondertussen worden floëemelementen die alleen uit primaire celwanden bestaan, geïdentificeerd door hun dunnere en donkerdere celwanden. Artefacten door autofluorescentie zijn te zien in glycolmethacrylaatharssecties.

Deze artefacten zijn meestal gerelateerd aan fluorochrome concentratie en kunnen worden vermeden door de monsters een groter aantal keren te wassen met de buffer. Het gedeelte uit de vrije hand van de wortel toont interne en externe schimmeldraden. Hetzelfde orgaan kan worden gezien door scanning elektronenmicroscopie met een overvloed aan rhizomorfen en individuele schimmeldraden op het oppervlak.

De meeste orchideeënsoorten ontkiemen binnen enkele weken na besmetting door de geënte schimmel of tot bijna meer dan een maand. Licht in scanning elektronenmicroscopie kan worden toegepast op bloemen, fruit en zaden om de reproductieve biologie of mycoheterotrofe planten te onderzoeken. Symbiotische kieming van zaden kan ook worden getest in autotrofe orchideeën.