Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

Het algemene doel van deze procedure is om microscopie te gebruiken als een hulpmiddel om de fagocytose van de pathogene schimmelsoort Cryptococcus neoformans te bestuderen door zijn milieuroofdier amoebe. Deze video beschrijft een protocol voor het voorbereiden van een co-cultuur van cryptokokkencellen en amoebe die ik zal bestuderen met behulp van confocale laser scanning microscopie en transmissie elektronenmicroscopie. Informatie verkregen uit het gebruik van deze technieken kan werpen inzichten in het gedrag van cryptokokkencellen wanneer geïnternaliseerd tijdens infectie.

Streep uit de test schimmel stammen op YPD agar platen. Broed de plaat 48 uur uit bij 30 graden Celsius. Schraap een lus vol cellen van de 48-uur-oude plaat en inenting ze in een 250-milliliter conische kolf met 100 milliliter van YNB bouillon die wordt aangevuld met 4%glucose.

Broed de kolf 24 uur lang op 30 graden Celsius op een roterende shaker. Tel na een incubatietijd van 24 uur de schimmelcellen met behulp van een hemocytometer en pas het celnummer aan op een miljoen cellen per milliliter met fysiologische bufferoplossing. Cultiveren amoebe cellen in pepton gist extract glucose bouillon voor een week op 30 graden Celsius.

Tel de amoebecellen met behulp van een hemocytometer en pas het celnummer aan op 10 miljoen cellen per milliliter met vers steriel ATCC medium 712. Voer hierna een levensvatbaarheidstest uit met behulp van een trypanblauwe vlek. Het is raadzaam om te werken met cellen die ten minste 80% levensvatbaarheid vertonen.

Doe een 200 microliter suspensie van gestandaardiseerde amoebecellen in kamers van een aanhanger dia. Laat twee uur passeren voor cellen te hechten aan het oppervlak op 30 graden Celsius. Terwijl amoebe cellen zich vestigen, bevlekken de gestandaardiseerde cryptokokkencellen met fluoresceïne isothiocyanaat.

Roer de schimmelcellen zachtjes twee uur op kamertemperatuur en in het donker. Doseer 200 microliter suspensie van gekleurde cryptokokkencellen na het wassen naar geschikte kamers die al amoebecellen bevatten. Broed de voorbereide co-cultuur op 30 graden Celsius voor een extra periode van twee uur.

Aan het einde van de coincubatieperiode was je de kamers twee keer met PBS om niet-gebonden amoebecellen te verwijderen, inclusief niet-geïnternaliseerde cryptokokkencellen. Aspirate de glutaraldehyde die werd gebruikt om de cellen vast te stellen, en was de kamer twee keer met PBS. Ontmantel de kamerglijbaan.

Bekijk de co-gekweekte cellen met behulp van een confocale laser-scanning microscoop. Als aanvulling op de bovenstaande test, vlek de cryptococcale cellen met pHrodo kleurstof die selectief zorgt voor het lezen van cellen gevangen in het voedsel vacuole. Doe deze gekleurde cellen in de putten van een zwarte aanhangende microtiterplaat die al gezaaide amoebecellen bevat.

Meet fluorescentie op een microplatelezer die logaritmische signalen kan omzetten in relatieve fluorescentie-eenheden. Voeg vijf milliliter gestandaardiseerde cryptokokkencellen toe aan dezelfde centrifugebuis die al vijf milliliter gestandaardiseerde amoebecellen bevat. Laat de buis twee uur staan bij 30 graden Celsius.

Aspirate de supernatant na centrifugatie. Bevestig de pellet die de co-gekweekte cellen vertegenwoordigt met één kies natriumfosfaat gebufferd 3%glutaraldehyde bij pH 7 gedurende drie uur. Was de co-gekweekte cellen eenmaal met natriumfosfaatbuffer.

Fix opnieuw voor 1 1/2 uur in eveneens gebufferde 1%osmium tetroxide gevolgd door wassen. Dehydrateer het TEM-materiaal dat ook wel bekend staat als de co-gekweekte cellen in een gesorteerde acetonserie van 30%50%70%95% en 100% gedurende elk 15 minuten. Herhaal hier de laatste uitdrogingsstap in twee veranderingen.

Bereid de epoxy hars door af te wegen epoxy van de normale consistentie. Insluit materiaal in de epoxy hars. Polymeriseer het TEM-materiaal gedurende acht uur bij 70 graden Celsius.

Snijd 16 nanometer secties met glazen messen gemonteerd op de ultratome. Bevlek de secties met uranylacetaat gedurende 10 minuten in het donker, gevolgd door loodcitraat gedurende 10 minuten, ook in het donker. Bekijk de secties met een transmissieelektronenmicroscoop.

Voor illustratieve doeleinden worden in de video twee isolaten onderzocht, een die 3-hydroxy vetzuur produceert en de andere die dat niet doet. 3-hydroxy vetzuren zijn secundaire metabolieten die geen rol spelen in de groei van cryptokokkencellen. Hier zijn snapshots die interactieve momenten tussen Cryptococcus en amoebe laten zien.

To the point, een cryptokokkencel voor en na internalisatie kan worden waargenomen. Bij het bestuderen van fagocytose is het ideaal om gebruik te maken van live beeldvorming. Het is echter niet altijd mogelijk voor onderzoekers om toegang te hebben tot een dergelijke microscoop om het proces van fagocytose continu te volgen.

Een mogelijke oplossing om deze beperking te compenseren kan zijn om beelden aan te vullen met kwantitatieve gegevens door het lezen van relatieve fluorescentie-eenheden. De staafgrafiek is een voorbeeld van gegevens die ik gebruikte om de beelden aan te vullen. Belangrijk is dat zowel de kwalitatieve gegevens in de vorm van beelden als de kwantitatieve gegevens in de loop van de tijd op verschillende tijdstippen kunnen worden genomen.

Door alle informatie te piecing, kan men beginnen met het construeren van een groter beeld van wat er gebeurt tijdens het proces van fagocytose. Uit de kwantitatieve gegevens blijkt duidelijk dat de cellen met 3-hydroxy vetzuren minder gevoelig zijn voor amoebe-werking in vergelijking met cellen die geen 3-hydroxy vetzuur produceren omdat er minder cellen worden geïnternaliseerd. De TEM is vooral een krachtig hulpmiddel omdat het een vogelvlucht in het lumen van het voedsel vacuole kan geven vanwege zijn hoge resolutie kracht, en dit is het soort detail dat vaak wordt gemist bij het onderzoeken van live beeldvorming en stilstaande beelden.

In deze specifieke TEM-micrograaf zijn uitstulpige stoffen op het oppervlak van cryptokokkencellen duidelijk te zien. Voorheen werd geschaofd dat deze celoppervlakstructuren kanalen zijn waarmee 3-hydroxy vetzuren worden vrijgegeven in de omgeving. Tot het punt, deze kanalen kunnen helpen om 3-hydroxy vetzuren te leveren in het lumen van het voedsel vacuole van amoebe om de interne omstandigheden te veranderen, vandaar de bevordering van celoverleving.

pHrodo of zoals FITC kan een veel betere vlek te gebruiken als het alleen fluoresceren bij een lage pH, zoals in het voedsel vacuole. Om specifiek te zijn, pHrodo staat de onderzoeker alleen toe om gegevens over geïnternaliseerde cellen te verkrijgen. Daarom is het belangrijk dat cellen worden opgehangen in fosfaatbufferoplossing voordat ze worden bevlekt en dat amoebemedia een neutrale pH heeft.

Transmissie elektronenmicroscoop exploitanten moeten goed worden opgeleid om goed sectie als dit is vaak het punt waar de resultaten kunnen worden vervormd en micrograaf beschadigd door elektronenbombardement. Het is de bedoeling dat onderzoekers in staat zullen zijn om voldoende informatie uit het gepresenteerde protocol te halen en te optimaliseren in hun eigen studies. Bovendien kunnen onderzoekers ook antilichamen tegen gerichte metaboliet ontwikkelen en toepassen tijdens hun immunofluorescente microscopiestudie, waaronder immunogold-etikettering tijdens het TEM-onderzoek.