Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

Dit protocol maakt het mogelijk om een goede isolatie van extracellulaire vesikels en melding van een hoger aantal EBDF-eiwitten te garanderen. In vergelijking met andere isolatietechnieken, deze stelt dat het meer integriteit en verticale activiteiten. EV's worden meer en meer bestudeerd in LC en pathologische omstandigheden.

Deze methode kan worden toegepast op alle systemen die we kiezen om de EV's te karakteriseren en te bestuderen. Voor die inhoud of de biologische ethiek is speciale aandacht nodig bij het itereren van EV's, zoals in de cultuur resulteert in de volgende experimenten. Een visuele demonstratie is van cruciaal belang voor het hosten van specifieke apparatuur, zoals een zelfgemaakte grootte uitsluiting chromatografie kolom evenals de betrokkenheid van nanodeeltjes teller en massa spectrometer.

Helpen om de procedure aan te tonen zal Antonella Raffo-Romero, een van het laboratorium. Begin met het pre-isoleren van extracellulaire vesicles, of EV's, van conditiemedium. Breng de conditie over naar cultuurmedium van microglia- of macrofaagculturen in een conische buis en verhoog deze met 1,200 keer G gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren.

Breng de supernatant in een nieuwe conische buis en centrifuge voor nog eens 20 minuten om apoptotische lichamen te elimineren. Breng de supernatant vervolgens over in een 10,4 milliliter polycarbonaatbuis. Plaats de buis in een 70.1 TI rotor en ultra centrifuge op 100, 000 keer G gedurende 90 minuten op vier graden Celsius om de EV's pellet.

Gooi na centrifugatie de supernatant weg en verleg de pellet in 200 microliter van 0,2 micrometer gefilterde PBS. Om de EV's te isoleren, bereidt u een zelfgemaakte grootte uitsluiting chromatografie kolom door het wassen en steriliseren van een glas chromatografie kolom, en het plaatsen van een 60 microliter filter aan de onderkant. Stapel de kolom met cross-linked agarose gel filtratie basismatrix om een stationaire fase van 0,6 centimeter in diameter en 20 centimeter hoog te creëren.

Spoel vervolgens de fase af met 50 milliliter van 0,2 micro meter gefilterde PBS. Bewaar indien nodig de kolom op vier graden Celsius voor later gebruik. Plaats de geresuspended EV pellet op de top van de stationaire fase en verzamel 20 opeenvolgende fracties van 250 microliters terwijl u PBS blijft toevoegen aan de bovenkant van de stationaire fase.

De fracties kunnen worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Om een nanodeeltjes tracking analyse uit te voeren, maak een verdunning van elke fractie met 0,2 micrometer gefilterde PBS en vortex het om aggregaten te elimineren. Doe de oplossing in een spuit van één milliliter en plaats deze in de automatische spuitpomp.

Pas vervolgens de camera-instellingen aan op het juiste schermverkrijgsniveau en cameraniveau en klik op Uitvoeren. Laad het monster in de analysekamer met een infusiesnelheid van 1000 gedurende 15 seconden. Verlaag en stabiliseer vervolgens de snelheidsstroom voor video-opname tot een infusiesnelheid van 25 gedurende 15 seconden.

Leg drie opeenvolgende video's van 60 seconden van de deeltjesstroom vast. Pas vervolgens het cameraniveau en de detectiedrempel aan voor video-analyse. Klik op Instellingen OK om de analyse te starten en klik op Exporteren wanneer u klaar bent.

Was het systeem met een milliliter van 0,2 micrometer gefilterde PBS tussen elke fractie. Als u elektronenmicroscopieanalyse uitvoert, gebruikt u een centrifugaalfilter van 50 kilodalton om de groottechromatografiefracties van belang te concentreren. Voor eiwitextractie meng je 50 microliter RIPA-buffer gedurende vijf minuten op ijs met het EV-monster.

Sonicate de monsters drie keer op 500 Watt en 20 kilohertz gedurende vijf seconden. Verwijder vervolgens vesiculaire brokstukken door te centrifugeren op 20.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na het isoleren van de eiwitten voert u eiwitmigratie uit in de stapelgel van een 12%polyacryle gel.

Meng de eiwitten in de gel met Coomassie Blue gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Dan accijnzen elk gekleurde gel stuk en snijd het in kleine stukjes. Leg de gelstukken door een reeks opeenvolgende wasbeurten zoals beschreven in het manuscript.

Droog ze vervolgens volledig met een vacuümconcentrator. Na het drogen uit te voeren eiwitverkleining met 100 microliter van 100 millimolar ammonium bicarbonaat met 10 millimolar Dithiothreitol gedurende een uur bij 56 graden Celsius. Vervolgens voeren eiwitalkylation met 100 microliters van 100 millimolar ammonium bicarbonaat met 50 millimolar iodoacetamide gedurende 45 minuten in het donker.

Was de gelstukken volgens de handschriftrichtingen en droog ze volledig op de vacuümconcentrator. Voer eiwitvertering uit met 50 microliters trypsine in 20 millimolar ammoniumbicarbonaat bij 37 graden Celsius 's nachts. Haal de volgende dag de verteerde eiwitten uit de gel met 50 microliters van 100%ACN gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur met continu roeren.

Haal vervolgens twee maal de eiwitten met 50 microliter van 5%TFA in 20 millimolar ammoniumbicarbonaat, terwijl u 20 minuten onophoudelijk roert. Voeg 100 microliter van ACN toe en blijf 10 minuten roeren. Droog daarna de eiwitten en resuspend ze in 20 microliters van 0,1%TFA.

Desalt het monster met behulp van een 10 microliter pipet tip met C 18 omgekeerde fase media voor desalting en concentratie peptiden. Dan elute ze met ACN en 0,1%mierenzuur. Droog het monster volledig met een vacuümconcentrator en zet het opnieuw op in 20 microliter acn en 0,1% mierenzuur voor vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie, of LC-MS.

Laad de verteerde peptiden in het instrument en voer een monsteranalyse uit. Om de isolatie van EV's te bevestigen, werd elke SCC-fractie onderworpen aan een nanodeeltjestrackinganalyse. Het deeltjesgetal was aanzienlijk hoger in de fracties vijf, zes en zeven.

Deze fracties werden samengevoegd in een steekproef 2F-EV positief, en vergeleken met EV negatieve fracties, 1F-EV negatief en 3F-EV negatief, met behulp van westerse vlek analyse. De resultaten toonden de aanwezigheid van warmteshock eiwit 90 in de EV positieve monster en in de cel lysate controle. Elektronenmicroscopie van het EV-positieve monster toonde EV's in een groottebereik van ongeveer 100 nanometer en 400 nanometer.

Proteomics analyse werd uitgevoerd om verontreiniging eiwitten te identificeren in EV negatieve monsters en karakteriseren het eiwitgehalte van EV's. De geïdentificeerde eiwitten werden vergeleken tussen 1F-EV negatief en een 2F-EV positieve monsters, evenals tussen 2F-EV positieve en een 3F-EV negatieve monsters. Met behulp van deze niet-gerichte methode werd een pool van 536 eiwitten voorgelegd aan de ExoCarta database en leidde tot de identificatie van 86 EV geassocieerde eiwitten.

Bovendien, deze pool ook toegestaan voor het identificeren van eiwit interacties en de bijbehorende biologische functies. Het bleek dat de eiwitten uit de EV positieve monster rol gespeeld in immuun en neuroprotectieve trajecten. De effecten van microglia-afgeleide EV's werden geëvalueerd op neurite uitgroei met PC 12 cellen en rat primaire neuronen.

Bij EV's was een aanzienlijke groeistijging te zien ten opzichte van de besturing. Macrofaag-afgeleide EV's werden geëvalueerd op glioom cel invasie. Het bleek dat EV's de groei en invasie van glioom sferoïden schaadden.

Het belangrijkste om te onthouden is om echt zorgvuldig gooi de supernatant van de ultracentrifugatie stap om het verlies van EV's in deze procedure te voorkomen. Wij zijn voorstander van een grootschalige en niet-gerichte aanpak om ons te concentreren op het hele eiwitgehalte en vervolgens het verticale effect van EV's. dus inhoud in nucleïnezuren kan worden geassocieerd met behulp van analyse.

Met deze aanpak vanuit een primaire cultuur zijn we in staat om onderscheid te maken tussen EV-eiwitten en vrije eiwitten die buiten de variëteit vallen. Dus de vraag blijft of deze stolling is artefactuele of liever een andere echte