Name: Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer een phalloidine-kleuringstechniek voor het visualiseren van epitheelcelmonolagen in microfluïdische kweekomgevingen met confocale laserscanmicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ARDS en VILI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Alan Shepardson voor het ontwerpen van het snijpatroon voor de 3M-lijm en mylar-plaat die wordt gebruikt in de microfluïdische kanaalconstructie en voor het testen van de celkweekmediastroomsnelheid en spuitpompprogrammering. Financiering werd geleverd door NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 en de Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

<ol><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory distress syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).</li>
<li>Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+distress+syndrome%3A+An+update+and+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory distress syndrome: An update and Review.</a> Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).</li>
<li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+surface-tension-induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).</li>
<li>Modrykamien, A. M., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Baylor+University+Medical+Center+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome.</a> Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).</li>
<li>Jacob, A. -M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+Claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4.</a> Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).</li>
<li>Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+gradient%2C+not+exposure+duration%2C+determines+the+extent+of+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+influence+of+cell+topography+on+epithelial+mechanical+stresses+during+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening.</a> Physics of Fluids. 17 (3), 031502(1994).</li>
<li>Gaver, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POOR+get+POORer%3A+A+hypothesis+for+the+pathogenesis+of+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+ultra-thin+alveolar-capillary+basement+membrane+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics.</a> Advanced Biology. 5 (8), 2000427(2021).</li>
<li>Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+the+tumor+microenvironment+under+controlled+oxygen+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions.</a> Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Jaccard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+the+rapid+and+precise+estimation+of+adherent+cell+culture+characteristics+from+phase+contrast+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).</li>
<li>Hagiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modest+static+pressure+suppresses+columnar+epithelial+cell+growth+in+association+with+cell+shape+and+cytoskeletal+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications.</a> Frontiers in Physiology. 8, 00997(2017).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids.</a> The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+on+bacterial+cellular+dimensions+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Iscience%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity.</a> Iscience. 24 (4), 102348(2021).</li>
<li>Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLust%2C+RM+%22The+Pulmonary+System.+XPharm%3A+The+Comprehensive+Pharmacology+Reference%22">The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference</a>. , Elsevier. 1-6 (2007).</li>
<li>EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EpilogueLaser%22">EpilogueLaser</a>. , Golden, CO: Author. (2022).</li>
<li>Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+disinfection+by+exposure+to+germicidal+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Surface disinfection by exposure to germicidal UV light.</a> Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241(2008).</li>
<li>Sandell, L., Sakai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell culture.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4(2011).</li>
<li>New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22New+Era+Pump+Systems%22">New Era Pump Systems</a>. , Farmingdale, NY. (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thermo+Fisher+Scientific%22">Thermo Fisher Scientific</a>. , Waltham, MA. (2018).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunocytochemical+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thermo+Fisher+Scientific%22">Thermo Fisher Scientific</a>. , Walther, MA. (2022).</li>
<li>Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML</a> (2022).</li>
<li>Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+media%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dr.+NTR+University+of+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mounting media: An overview.</a> Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).</li>
<li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916(2021).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Ferriera, F., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+User+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">ImageJ User Guide.</a> National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+fibronectin+by+human+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Production of fibronectin by human epithelial cells in culture.</a> American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).</li>
<li>Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSieck%2C+GC+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 307, Academic Press. 296-315 (1999).</li>
<li>Heijink, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell+adhesion+in+airway+epithelial+cell+types+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretchable+impedance+sensor+for+mammalian+cell+proliferation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Het gepresenteerde protocol beschrijft de cultuur, crosslinking fixatie, kleuring, permeabilisatie en confocale microscopische visualisatie van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen in de dynamische omgeving van een eenkanaals microfluïdische stroomarray, evenals in de statische omgeving van een traditioneel acht-goed gekamerd coverglas. Bij elk microfluïdisch celkweekprotocol zijn de stroomomstandigheden van de celkweekmedia van het grootste belang, omdat de snelle stroom het potentieel heeft om de cellen weg te spoele...

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een acute aandoening die voortvloeit uit belediging en verspreiding van letsel in het longparenchym, resulterend in longoedeem van de longblaasjes, onvoldoende gasuitwisseling en daaropvolgende hypoxemie1. Dit initieert een cyclus van pro-inflammatoire cytokine-afgifte, neutrofiele rekrutering, toxische mediatorafgifte en weefselschade, die zelf een verdere ontstekingsreactie veroorzaakt2. Bovendien kan pulmonale oppervlakteactieve stof, die de luchtwegen stabiliseert en schade voorkomt die wordt veroorzaakt door repetitieve rekrutering / derekrutering (R / D), worden geïnactiveerd of anderszins disfunctioneel worden gemaakt door de chemische processen die optreden tijdens ARDS, wat resulteert in verdere stress en letsel aan het omliggende parenchym3. Als er voldoende schade wordt opgelopen, kan mechanische ventilatie nodig zijn om voldoende systemische oxygenatie te garanderen4. Mechanische beademing brengt echter zijn eigen uitdagingen en trauma's met zich mee, waaronder de mogelijkheid van door beademingsapparatuur geïnduceerd longletsel (VILI), gekarakteriseerd als letsel aan het longparenchym veroorzaakt door de mechanische spanningen die worden opgelegd tijdens overinflatie (volutrauma) en/of de R/D van de lucht-vloeistofinterface in de vloeistof-afgesloten luchtweg (atelectrauma)5. De drukgradiënt die wordt ervaren door epitheelcellen die worden blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface (zoals in een met vloeistof afgesloten bronchiol) in het atelectraumamodel kan resulteren in een permeabiliteitsgerelateerde obstructieve respons (POOR), wat leidt tot een POOR-get-POORer deugdzame cyclus van letsel 6,7,8.
In vitro experimenten kunnen op microschaal inzicht geven in deze verschijnselen, maar de huidige studies in microfluïdische kanaalomgevingen met fysiologisch relevante dimensies staan voor verschillende uitdagingen9. Ten eerste vormt het optimaliseren van celkweekomstandigheden een belangrijke barrière voor toegang tot celkweekonderzoek in microfluïdische omgevingen, omdat er een smalle kruising bestaat waarbinnen mediastroomparameters, kweekduur en andere kweekomstandigheden optimale cellaagvorming mogelijk maken. Dit omvat de diffusiebeperkingen die worden opgelegd door de zuurstofondoordringbare aard van de microfluïdische kweekkanaalbehuizing. Dit vereist een zorgvuldige afweging van mediastroomparameters, omdat lage stroomsnelheden cellen van zuurstof kunnen beroven, vooral die het verst van de inlaat verwijderd zijn; Aan de andere kant kunnen hoge stroomsnelheden cellen uit het kweekkanaal duwen of resulteren in onjuiste of ongelijke laagontwikkeling. Diffusiebeperkingen kunnen worden aangepakt door zuurstofdoorlatende materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) te gebruiken in een lucht-vloeistofinterface (ALI) kweekapparaat; veel conventionele microfluïdische kweekkanalen, zoals die van het elektrische celsubstraatimpedantiedetectiesysteem (ECIS), zijn echter inherent zuurstofondoordringbaar, gezien de aard van de vervaardigde behuizing10. Dit protocol heeft tot doel een techniek te bieden voor het analyseren van cellagen gekweekt in een zuurstof-ondoordringbare behuizing.
Bij het vergelijken van de levensvatbaarheid van kweekomstandigheden zijn waarnemingen van specifieke laagkenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag, oppervlaktetopologie, confluentie en uniformiteit van de laagdikte, noodzakelijk om te bepalen of de cellaag die door een bepaalde reeks kweekomstandigheden wordt geproduceerd, voldoet aan de gewenste specificaties en inderdaad relevant is voor het experimentele ontwerp. Een beperkte evaluatie kan worden uitgevoerd met methoden zoals ECIS, die gebruik maakt van metingen van elektrische potentiaal (spanning) gecreëerd door weerstand tegen hoogfrequente wisselstroom (AC) (impedantie) opgelegd door elektrisch isolerende membranen van cellen gekweekt op gouden elektroden binnen de stroomarray. Door de frequentie van AC toegepast op cellen te moduleren, kunnen specifieke frequentie-afhankelijke cellulaire eigenschappen van de cellen en cellagen zoals oppervlaktetrouwsterkte, tight-junction-vorming en celproliferatie of confluentie worden gericht en onderzocht11. Deze indirecte vormen van metingen zijn echter enigszins moeilijk te interpreteren aan het begin van een experiment en kwantificeren mogelijk niet alle relevante aspecten van de cellaag. Alleen al het observeren van de cellaag onder een fasecontrastmicroscoop kan de aard van bepaalde kwaliteiten zoals confluentie onthullen; veel relevante kenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag en uniformiteit van de laagdikte, vereisen echter een driedimensionale (3D) evaluatie die niet mogelijk is met brightfield, fasecontrast of fluorescerende microscopische beeldvorming12.
Het doel van deze studie was om een filamenteuze actinekleuringstechniek te ontwikkelen om op beeldvorming gebaseerde verificatie van een monolaag en de evaluatie van cellaaguniformiteit met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) mogelijk te maken. Filamenteuze actine (F-actine) werd beschouwd als een geschikt doelwit voor het fluorofoorconjugaat, deels vanwege de manier waarop F-actine het celmembraan strak volgt, waardoor een visuele benadering van het volledige celvolumemogelijk is 13. Een ander belangrijk voordeel van het richten op F-actine is de manier waarop kleuring van F-actine visueel cytoskeletale verstoringen of veranderingen opheldert die worden opgelegd door de spanningen en stammen die door de cellen worden ervaren. Crosslinking fixatie met methanolvrij formaldehyde werd gebruikt om de morfologie van de cellen en de cellaag te behouden, omdat uitdrogende fixatieven zoals methanol de neiging hebben om cellen af te vlakken, de cellaag ernstig te vervormen en de eigenschappen ervan te veranderen14,15.
Om het vermogen van de laagevaluatietechniek te bepalen om deze uitdagingen te verminderen, werden cellen gekweekt in traditionele kweekkamers met acht putten en in microfluïdische kanalen om de eventuele verschillen in de geproduceerde cellagen te evalueren. Voor vaste kweekputten werden acht putvormige afdekglasunits gebruikt. Voor microfluïdische cultuur werden flowarrays (kanaallengte 50 mm, breedte 5 mm, diepte 0,6 mm) geoptimaliseerd om vereeuwigde menselijke longepitheelcellen (NCI-H441) te kweken in een omgeving met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen die aanwezig zijn in de ademhalingszone van de menselijke long16. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met de kweekomgeving van ECIS-flowarrays in gedachten, kan het van toepassing zijn op elke zuurstofondoordringbare dynamische cultuuromgeving waarvoor evaluatie van gekweekte cellaagkenmerken of kweekomstandigheden noodzakelijk is.

<table><tbody><tr><td>A1R HD25 Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>Adhesive Transfer Tape Double Linered</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr><tr><td>Air-Tite&nbsp;HSW Soft-Ject Disposable Syringes</td><td>Air-Tite RL5</td><td>14-817-53</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td></tr><tr><td>BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics&nbsp;M Series Ultrasonic Cleaning Bath</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Fibronectin, Human</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnesium</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td></tr><tr><td>ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array</td><td>Applied BioPhysics</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White</td><td>Enterprise Technology Solutions</td><td>50-211-1163</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Cover Glasses: Rectangles (#1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Syringes for Single Use</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>ImageJ</td><td>ImageJ Fiji</td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Immersion Oil F 30 cc</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td></tr><tr><td>Large-Capacity Reach-In CO2&nbsp;Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&amp;persist=true&amp;ip=no&amp; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>National Target All-Plastic Disposable Syringes</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-174</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td></tr><tr><td>NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td></tr><tr><td>Parafilm M Wrapping Film</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-

voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

In vitro microfluïdische experimenten hebben een groot potentieel om veel inzichten te onthullen in de microfysiologische verschijnselen die optreden bij aandoeningen zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS) en door beademingsapparatuur geïnduceerde longschade (VILI). Studies in microfluïdische kanalen met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long worden momenteel echter geconfronteerd met verschillende uitdagingen, vooral als gevolg van problemen bij het vaststellen van geschikte celkweekomstandigheden, waaronder mediastroomsnelheden, binnen een bepaalde kweekomgeving. Het gepresenteerde protocol beschrijft een beeldgebaseerde benadering om de structuur van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen gekweekt in een zuurstofondoordringbaar microfluïdisch kanaal te evalueren met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long. Met behulp van falloidine-gebaseerde filamenteuze actinekleuring worden de cytoskeletale structuren van de cellen onthuld door confocale laserscanmicroscopie, waardoor zowel individuele als gelaagde cellen kunnen worden gevisualiseerd. De daaropvolgende kwantificering bepaalt of de toegepaste celkweekomstandigheden uniforme monolagen produceren die geschikt zijn voor verdere experimenten. Het protocol beschrijft celkweek- en laagevaluatiemethoden in microfluïdische kanalen en traditionele fixed-well-omgevingen. Dit omvat kanaalconstructie, celkweek en vereiste omstandigheden, fixatie, permeabilisatie en kleuring, confocale microscopische beeldvorming, beeldverwerking en gegevensanalyse.

De gepresenteerde methode maakt de visualisatie mogelijk van epitheelcellagen gekweekt in microfluïdische cultuurkanalen en gebruikt een demonstratie in traditionele celkweekomgevingen met vaste put als validatie. De verkregen beelden bestaan op een spectrum van kwaliteit, signaalintensiteit en cellulaire doelspecificiteit. Succesvolle afbeeldingen zullen een hoog contrast vertonen, waardoor beeldanalyse en kwantificering van gegevens mogelijk is voor latere statistische evaluatie. Niet-succesvolle afbeeldingen zijn vaag...

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Dit protocol dient om een toegangsdrempel voor celkweekexperimenten te verlagen en stelt onderzoekers in staat om adherente celmonolagen gekweekt in dynamische microfluïdische omgevingen te evalueren en te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zowel kwalitatieve als kwantitatieve evaluatie van celmonolaagkarakteristieken mogelijk maakt om als basis te dienen voor verdere monolaagafhankelijke experimenten. Deze methode maakt de recapitulatie van een alveolair epitheel in vitro mogelijk, waardoor de dynamische reacties tijdens acuut respiratoir distresssyndroom, ARDS, evenals door beademingsapparatuur geïnduceerd longletsel, VILI, kunnen worden onderzocht.Zorg om te beginnen voor een stroomarray met één kanaal. Reinig het glasoppervlak van de afdekking in een ultrasoon bad. Dompel het afdekglas gedurende vijf minuten onder in poly-d-lysine bij kamertemperatuur.Droog het vervolgens 30 minuten op 60 graden Celsius. Breng vervolgens dubbelzijdige lijmen aan in Mylar-afstandhouders. Lasergesneden zoals beschreven in het manuscript op het dekglas en zorg ervoor dat de kanaaluitsparingen nauwkeurig zijn uitgelijnd.Bevestig een rechthoekig dekglas op de onderste plakstrip. Gebruik het geschild zelfklevende papier om de nog blootgestelde delen van de lijm te bedekken. Nadat de montage is voltooid, oefent u stevige en gelijke druk uit op de constructie.Gebruik een spuit gevuld met gedeïoniseerd water en spoel het kanaal af. Steriliseer de kanaalbehuizing gedurende 30 minuten in een ultraviolette sterilisator. Gebruik een steriele techniek om het kanaal te behandelen met een humane fibronectine-oplossing bereid in PBS en gedurende ten minste 30 minuten te incuberen bij 37 graden Celsius.Bereid in de steriele laminaire stromingskap NCI H441-celsuspensie voor met RPMI 1640-medium met 10% FBS. Gebruik 0,25 milliliter van deze celophanging om het kanaal en een deel van de poorten te vullen. Controleer met behulp van brightfieldmicroscopie of de cellen gelijkmatig binnen de kanalen zijn verdeeld.Voeg het mediareservoir en de stopkraan toe aan het kanaal. Begin met het kweken van het kanaal bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gebruik een programmeerbare spuitpomp om gebruikte media uit het kanaal te trekken en verse media in het kanaal uit een steriel mediareservoir dat aan de kanaalinlaat is bevestigd.Verdun in een chemische zuurkast een 4% formaldehyde-oplossing tot DPBS om een 1%-oplossing te creëren en op te slaan in een correct gelabelde buis. Bereid de 2% formaldehyde-oplossing op een vergelijkbare manier. Breng de formaldehyde-oplossingen over in correct geëtiketteerde spuiten van vijf milliliter.Zuig 20 milliliter DPBS op in een aparte spuit van 20 milliliter die zal worden gebruikt voor de wasstappen. Verwijder vervolgens het microfluïdische kanaal uit het kweekapparaat en zet het vast in de chemische zuurkast. Om het bevestigings- en kleuringsapparaat te monteren, bevestigt u een segment van de overdrachtsbuizen aan de zijpoort van een driewegstopkraan via een mannelijke Luer-vergrendeling aan de slanghaakadapter.Sluit vervolgens de stopkraan aan op de inlaatpoort van de flow array. Bevestig een ander segment van de overdrachtsbuizen aan de uitlaatpoort van de bestaande stopkraan met behulp van hetzelfde type slanghaakadapter. Bevestig ten slotte de vrije uiteinden van beide overbrengingsbuizen die nu als afvalleidingen zijn aangewezen, in een chemische en biogevaarlijke afvalcontainer.Zorg ervoor dat de stopkraan de inlaatpoort van de stroomarray blokkeert en spoel de afvalleiding met DPBS. Draai vervolgens aan de stopkraan om de afvallijn af te sluiten en was de cellen langzaam met twee milliliter DPBS. Duw langzaam twee milliliter 1% fixatief door het kanaal.Laat het vijf minuten zitten en herhaal met 2% fixatief. Was de cellen vervolgens drie keer met verse DPBS zoals eerder aangetoond. Bereid de 0,1% saponine-oplossing zoals beschreven in het manuscript.Trek extra DPBS op in een spuit van 20 milliliter voor gebruik in de wasstappen. Bedek de buis met aluminiumfolie. Voeg het filamenteuze actinekleuring falloïdinereagens en een nucleuskleuring Hoechst-reagens toe aan de 0,1% saponine-oplossing.Breng vervolgens de oplossing over in een met folie bedekte spuit. Spoel de afvallijn met een kleine hoeveelheid permeabiliserende en vlekoplossing. Breng vervolgens twee milliliter van de oplossing in het microfluïdische kanaal.Bedek het kanaal met aluminiumfolie om het licht te blokkeren. Spoel na 30 minuten de permeabiliserende oplossing met twee milliliter DPBS tweemaal gedurende vijf minuten elk weg voordat u het kanaal voorzichtig droogt. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde anti-fade mountant aan op het microfluïdische kanaal om ervoor te zorgen dat het bodemoppervlak volledig wordt bedekt.Sluit vervolgens het uiteinde van het kanaal af. Controleer met behulp van een brightfield-microscoop snel de integriteit van de cellaag voordat u het kanaal in een container opslaat om het tegen licht te beschermen. Test beeldvormingslocaties door referentiescans en z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan.Gebruik de basisplaat van de stroomarray als referentie en construeer z-stacks op verschillende locaties langs de lengte van het kanaal. Analyseer ten slotte cross-sectionele gegevens, dieptekaartgegevens en andere relevante kenmerken om de eigenschappen van de cellaag te evalueren. Het succesvolle gebruik van de techniek wordt aangetoond in de microfluïdische dynamische kweekomgeving door beeldacquisitie op minstens één centimeter afstand van de inlaat en de uitlaat.In een representatief cultuurduurexperiment werd een succesvolle monolaagproductie waargenomen wanneer de cellen gedurende 24 uur werden gekweekt. Bij een kweek gedurende 48 uur werd echter ongewenste meerlagige vorming gezien. De gegevens verzameld van elk van de vijf microfluïdische kanaalbeeldvormingslocaties onthullen ook de relatie tussen verhoogde kweekduur en toegenomen dwarsdoorsnedegebied, wat suggereert dat ongelijke laagvorming of overgroei optreedt binnen 48 uur na kweek.De dieptekaart van een centrale locatie binnen het microfluïdische kanaal dat gedurende 24 uur werd gekweekt, werd verkregen, wat nuttig is voor de kwalitatieve evaluatie van laagkenmerken. De drie meest cruciale aspecten van dit protocol zijn een goede kanaalconstructie, nauwkeurige kweek- en mediastroomomstandigheden en zorgvuldig gebruik van het fixatie- en kleuringsapparaat. Na deze procedure kunnen parallel andere methoden worden gebruikt om de experimentele levensvatbaarheid van de geproduceerde celmonolagen te valideren, zoals elektrische celsubstraatimpedantiedetectie, ECIS of transepitheliale elektrische weerstand, TEER.

preparation-structural-evaluation-epithelial-cell-monolayers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.

Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Het huidige protocol beschrijft de mogelijkheden en de essentiële kweekmodaliteiten van de Open-Top Organ-Chip voor de succesvolle vestiging en rijping van organ-on-chip culturen van volledige dikte van primaire weefsels (huid, alveolus, luchtwegen en darm), waardoor de mogelijkheid wordt geboden om verschillende functionele aspecten van de menselijke epitheliale / mesenchymale en vasculaire niche-interface in vitro te onderzoeken.

Reconstitutie cytoarchitectuur en functie van menselijke epitheelweefsels op een open-top orgaanchip

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Dit protocol beschrijft een herconfigureerbaar, op membraan gebaseerd celkweekplatform dat het open-well-formaat integreert met vloeistofstroommogelijkheden. Dit platform is compatibel met standaardprotocollen en maakt omkeerbare overgangen mogelijk tussen open-well en microfluïdische kweekmodi, om tegemoet te komen aan de behoeften van zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.

Statische barrièreweefselmodellen transformeren in dynamische microfysiologische systemen

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer een phalloidine-kleuringstechniek voor het visualiseren van epitheelcelmonolagen in microfluïdische kweekomgevingen met confocale laserscanmicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ARDS en VILI.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Meer video's verkennen