Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Dit protocol dient om een toegangsdrempel voor celkweekexperimenten te verlagen en stelt onderzoekers in staat om adherente celmonolagen gekweekt in dynamische microfluïdische omgevingen te evalueren en te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zowel kwalitatieve als kwantitatieve evaluatie van celmonolaagkarakteristieken mogelijk maakt om als basis te dienen voor verdere monolaagafhankelijke experimenten. Deze methode maakt de recapitulatie van een alveolair epitheel in vitro mogelijk, waardoor de dynamische reacties tijdens acuut respiratoir distresssyndroom, ARDS, evenals door beademingsapparatuur geïnduceerd longletsel, VILI, kunnen worden onderzocht.

Zorg om te beginnen voor een stroomarray met één kanaal. Reinig het glasoppervlak van de afdekking in een ultrasoon bad. Dompel het afdekglas gedurende vijf minuten onder in poly-d-lysine bij kamertemperatuur.

Droog het vervolgens 30 minuten op 60 graden Celsius. Breng vervolgens dubbelzijdige lijmen aan in Mylar-afstandhouders. Lasergesneden zoals beschreven in het manuscript op het dekglas en zorg ervoor dat de kanaaluitsparingen nauwkeurig zijn uitgelijnd.

Bevestig een rechthoekig dekglas op de onderste plakstrip. Gebruik het geschild zelfklevende papier om de nog blootgestelde delen van de lijm te bedekken. Nadat de montage is voltooid, oefent u stevige en gelijke druk uit op de constructie.

Gebruik een spuit gevuld met gedeïoniseerd water en spoel het kanaal af. Steriliseer de kanaalbehuizing gedurende 30 minuten in een ultraviolette sterilisator. Gebruik een steriele techniek om het kanaal te behandelen met een humane fibronectine-oplossing bereid in PBS en gedurende ten minste 30 minuten te incuberen bij 37 graden Celsius.

Bereid in de steriele laminaire stromingskap NCI H441-celsuspensie voor met RPMI 1640-medium met 10% FBS. Gebruik 0,25 milliliter van deze celophanging om het kanaal en een deel van de poorten te vullen. Controleer met behulp van brightfieldmicroscopie of de cellen gelijkmatig binnen de kanalen zijn verdeeld.

Voeg het mediareservoir en de stopkraan toe aan het kanaal. Begin met het kweken van het kanaal bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gebruik een programmeerbare spuitpomp om gebruikte media uit het kanaal te trekken en verse media in het kanaal uit een steriel mediareservoir dat aan de kanaalinlaat is bevestigd.

Verdun in een chemische zuurkast een 4% formaldehyde-oplossing tot DPBS om een 1%-oplossing te creëren en op te slaan in een correct gelabelde buis. Bereid de 2% formaldehyde-oplossing op een vergelijkbare manier. Breng de formaldehyde-oplossingen over in correct geëtiketteerde spuiten van vijf milliliter.

Zuig 20 milliliter DPBS op in een aparte spuit van 20 milliliter die zal worden gebruikt voor de wasstappen. Verwijder vervolgens het microfluïdische kanaal uit het kweekapparaat en zet het vast in de chemische zuurkast. Om het bevestigings- en kleuringsapparaat te monteren, bevestigt u een segment van de overdrachtsbuizen aan de zijpoort van een driewegstopkraan via een mannelijke Luer-vergrendeling aan de slanghaakadapter.

Sluit vervolgens de stopkraan aan op de inlaatpoort van de flow array. Bevestig een ander segment van de overdrachtsbuizen aan de uitlaatpoort van de bestaande stopkraan met behulp van hetzelfde type slanghaakadapter. Bevestig ten slotte de vrije uiteinden van beide overbrengingsbuizen die nu als afvalleidingen zijn aangewezen, in een chemische en biogevaarlijke afvalcontainer.

Zorg ervoor dat de stopkraan de inlaatpoort van de stroomarray blokkeert en spoel de afvalleiding met DPBS. Draai vervolgens aan de stopkraan om de afvallijn af te sluiten en was de cellen langzaam met twee milliliter DPBS. Duw langzaam twee milliliter 1% fixatief door het kanaal.

Laat het vijf minuten zitten en herhaal met 2% fixatief. Was de cellen vervolgens drie keer met verse DPBS zoals eerder aangetoond. Bereid de 0,1% saponine-oplossing zoals beschreven in het manuscript.

Trek extra DPBS op in een spuit van 20 milliliter voor gebruik in de wasstappen. Bedek de buis met aluminiumfolie. Voeg het filamenteuze actinekleuring falloïdinereagens en een nucleuskleuring Hoechst-reagens toe aan de 0,1% saponine-oplossing.

Breng vervolgens de oplossing over in een met folie bedekte spuit. Spoel de afvallijn met een kleine hoeveelheid permeabiliserende en vlekoplossing. Breng vervolgens twee milliliter van de oplossing in het microfluïdische kanaal.

Bedek het kanaal met aluminiumfolie om het licht te blokkeren. Spoel na 30 minuten de permeabiliserende oplossing met twee milliliter DPBS tweemaal gedurende vijf minuten elk weg voordat u het kanaal voorzichtig droogt. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde anti-fade mountant aan op het microfluïdische kanaal om ervoor te zorgen dat het bodemoppervlak volledig wordt bedekt.

Sluit vervolgens het uiteinde van het kanaal af. Controleer met behulp van een brightfield-microscoop snel de integriteit van de cellaag voordat u het kanaal in een container opslaat om het tegen licht te beschermen. Test beeldvormingslocaties door referentiescans en z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan.

Gebruik de basisplaat van de stroomarray als referentie en construeer z-stacks op verschillende locaties langs de lengte van het kanaal. Analyseer ten slotte cross-sectionele gegevens, dieptekaartgegevens en andere relevante kenmerken om de eigenschappen van de cellaag te evalueren. Het succesvolle gebruik van de techniek wordt aangetoond in de microfluïdische dynamische kweekomgeving door beeldacquisitie op minstens één centimeter afstand van de inlaat en de uitlaat.

In een representatief cultuurduurexperiment werd een succesvolle monolaagproductie waargenomen wanneer de cellen gedurende 24 uur werden gekweekt. Bij een kweek gedurende 48 uur werd echter ongewenste meerlagige vorming gezien. De gegevens verzameld van elk van de vijf microfluïdische kanaalbeeldvormingslocaties onthullen ook de relatie tussen verhoogde kweekduur en toegenomen dwarsdoorsnedegebied, wat suggereert dat ongelijke laagvorming of overgroei optreedt binnen 48 uur na kweek.

De dieptekaart van een centrale locatie binnen het microfluïdische kanaal dat gedurende 24 uur werd gekweekt, werd verkregen, wat nuttig is voor de kwalitatieve evaluatie van laagkenmerken. De drie meest cruciale aspecten van dit protocol zijn een goede kanaalconstructie, nauwkeurige kweek- en mediastroomomstandigheden en zorgvuldig gebruik van het fixatie- en kleuringsapparaat. Na deze procedure kunnen parallel andere methoden worden gebruikt om de experimentele levensvatbaarheid van de geproduceerde celmonolagen te valideren, zoals elektrische celsubstraatimpedantiedetectie, ECIS of transepitheliale elektrische weerstand, TEER.