Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Dit is het eerste protocol voor het genereren van biliaire cysten, het verstrekken van een systematische analyse die het mogelijk maakt de evaluatie van cystevorming, efficiëntie en grootte in de tijd. Deze methode maakt kwantitatieve beoordeling van epitheelcyste cystevorming mogelijk en maakt het mogelijk om dit proces te evalueren als functie van het type epitheliale cellen of hydrogel. Aangezien de therapeutische opties voor biliaire aandoeningen beperkt zijn, opent dit protocol de deur voor het standaardiseren van medicijnstudies, het identificeren van normale therapeutische doelen en het begrijpen van ziektemechanismen.

De eenvoudige methode maakt het mogelijk om belangrijke vragen over de mechanismen van nieuwe informatie binnen de bio-engineering van buisstructuren veld worden aangepakt. Ontdooi voor het begin van een experiment een geschikte hydrogeloplossing bij vier graden Celsius en precoole pipettips en een achtputkamerglijbaan bij min 20 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, plaats de hydrogel en een acht goed kamer glijbaan op ijs en voeg de juiste hoeveelheid hydrogel aan koude normale rat cholangiocyte compleet medium om 500 microliters van 40% hydrogel oplossing te verkrijgen.

Gebruik vervolgens de koude pipettips om 50 microliters hydrogeloplossing toe te voegen aan het midden van elke put van de kamerschaarste en gebruik een pipetpunt om de oplossing zo gelijkmatig mogelijk over het gehele oppervlak van de putbodem te verspreiden zonder bubbels. Om de cellen voor te bereiden op het experiment, terwijl de hydrogel polymeriseert, was de cellen van een 70%confluent normale rattencholangiocytecultuur met voorverwarmde PBS en ontcubeer de cellen met vijf milliliter verse voorverwarmde PBS gedurende 20 minuten in de incubator van de celkweek. Vervang aan het einde van de incubatie de PBS door één milliliter voorverwarmde Trypsin-EDTA en breng de kolf vijf tot tien minuten terug naar de couveuse van de celkweek.

Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de reactie met vier milliliter van voorverwarmde volledige normale rat cholangiocyte medium en breng de cellen naar een 15 milliliter buis voor centrifugatie. Dan opnieuw opschorten de pellet in vijf milliliter van voorverwarmd medium en filter de cellen door middel van een 40 micron zeef in een 50 milliliter buis voor het tellen. Om cysten te genereren, voeg het juiste volume hydrogel toe aan koude volledige normale rattencholangiocytenmedium om 1.600 microliter van een 80%hydrogeloplossing op ijs te verkrijgen en de cellen te verdunnen tot een vijf keer 10 tot de vijfde cel per milliliter koude normale rattencholangiocytenmediumconcentratie in 1, 600 microliter medium.

Meng onmiddellijk de cel- en hydrogelceloplossingen en voeg 400 microliter cellen toe aan elke put van de hydrogel gecoate kamerglijbaan, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Om de verwerving van reproduceerbare en significante resultaten te garanderen, moet u de hydrogel zorgvuldig behandelen en de initiële celwaterstofoplossing grondig mengen om een homogene oplossing te verkrijgen. Wanneer alle cellen zijn gezaaid, plaats de dia in de celcultuur incubator.

Na twee dagen in de cultuur, verwijder 250 microliter van het medium uit een hoek van elke put, zorg ervoor dat niet te spoelen uit de hydrogel, en langzaam vervangen van de afgedankte supernatant met 250 microliter van verse cultuur medium. Voor cystimaging, op de juiste dag van de cultuur, selecteert u de 10 X doelstelling op een fase contrastmicroscoop uitgerust met beeldacquisitie software, schakel de witte lamp en selecteer de brightfield imaging optie. Selecteer afspelen om de camera in te schakelen en je te concentreren op een veld van cysten.

Stel de belichtingstijd in en open het venster voor het automatisch vastleggen van de map om automatische besparing van de afbeeldingen mogelijk te maken. Open het capture Z-serie venster, reset de standaardpositie en gebruik de Z-schroef om de boven- en onderkant van de Z-stack te definiëren, waarbij de Z-stap wordt aangepast afhankelijk van het doel en het resolutieniveau. Klik vervolgens nu uitvoeren om de overname te starten.

Na beeldvorming, open de Z-stack in Fiji. Als u de stapel wilt dupliceren, klikt u op afbeelding, duplicaat en dubbele stapel. Als u een minimale intensiteitsprojectie wilt maken van de gedupliceerde stapels, selecteert u onder het afbeeldingsmenu stapels en het Z-project.

Selecteer de minimale intensiteit voor het projectietype en klik op oke. Als u de achtergrond van de projectie wilt aftrekken, selecteert u onder het procesmenu de achtergrond aftrekken en 500 pixels rollende bolletje en lichte achtergrond selecteren om de cysten meer contrasterend te maken dan de achtergrond. Als u de geschatte cystediameter wilt meten, zoomt u op de doelgerichte cyste, selecteert u het rechte lijngereedschap en drukt u op de T-knop op het toetsenbord.

Teken een lijn over de diameter van elke cyste op de uiteindelijke projectie. De volgende regio van belang gemaakt voor elke cyste zal worden toegevoegd aan de regio van belang manager. Wanneer alle cysten zijn geteld, klikt u op het Z-stack venster om het te selecteren en klik op toon alles om de geteld cysten te zien.

Verplaats de cursor langs de Z-stack om te controleren of alle cysten zijn geteld in elke afbeelding, het toevoegen van nieuwe cysten aan het gebied van belang manager als dat nodig is. Wanneer alle cysten zijn geteld, selecteert u het gebied van belang en klikt u op meer en slaat u op om de gegevens op te slaan. Klik op meten om de grootte van elke cyste te bepalen, waarbij de interessegebieden nog steeds zijn geselecteerd.

Er verschijnt een venster met elke cyste en de geschatte grootte. Sla vervolgens de gegevens op in CSV-indeling. Zoals aangetoond, het registreren van het aantal cysten en hun respectieve maten in de tijd maakt analyse van de evolutie van cystevorming en groei mogelijk.

De levensvatbaarheid van de startcelpopulatie en de 10 dagen oude cysten kan worden geëvalueerd door levende/dode vlekken. Dode cellen vertegenwoordigen minder dan 3% van de celpopulatie op dag 10 en bevinden zich meestal buiten de cyste als geïsoleerde cellen of als onderdeel van kleine aggregaten, hoewel sommige necrotische celrestenophoping wordt waargenomen binnen sommige grote cysten. Incubatie met fluoresceïne diacetaat en Hoechst maakt een beoordeling van de vorming en afscheiding van Fluoresceïne mogelijk van het basale naar de apicale luminale ruimte.

Met name wordt de afscheiding van Fluoresceïne geremd door voorbehandeling met een multiresistente remmer, wat aangeeft dat fluorescerende fluorescerende fluoresceïneaccumulatie in het lumen te wijten is aan afscheiding via de multiresistente transporter en niet uit de intercellulaire ruimte lekt. Vlekken op E-cadherin expressie blijkt dat de normale rattencholangiocyten hun epitheliale fenotype gedurende ten minste 10 dagen in de hydrogel behouden. Bij de voorbereiding van de cysten op immunofluorescentie is het bijhouden van het boviene serum albumine op 0,1% of minder tijdens verzadiging van cruciaal belang voor het handhaven van de integriteit van de cyste, omdat hogere concentraties resulteren in intrekking van cysten en instorting van lumen.

Nachtelijke hydrogel, ontdooien, pipettepunt en kamer dia opname, werken op ijs en het verspreiden van de homogene cel hydrogel mengsel gelijkmatig op de gekweekte kamer dia zijn allemaal van cruciaal belang voor experimenteel succes. Deze methode kan worden gebruikt om cysten te genereren uit andere epitheliale cellen of hydrogels, waardoor vergelijkingen voor een beter begrip van epitheliale polarisatie. Deze kwantitatieve methode kan worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen of genetische mutaties op galfunctie en organogenese te testen.