Onderzoek naar Caspase-mutaties en posttranslationele modificatie door moleculaire modelleringsbenaderingen

een sleutelrol spelen bij het initiëren en uitvoeren met behulp van moleculaire modellering. We bestuderen het effect van posttransformatiemodificaties en mutaties op de Caspase structuur en functie. We beschrijven de moleculaire dynamicabenadering die een beeld geeft van de evolutie van het eiwit, na de introductie van structurele modificaties op atomair niveau.

Een dergelijke benadering is een bijzondere betekenis van het begrijpen van de mechanismen die programmaceldood en bijbehorende stoornissen reguleren en het ontwikkelen van nieuwe effectieve therapieën. We demonstreren moleculaire modelleringsmogelijkheden met een van de meest populaire tools, Amber 20. Maar het gepresenteerde protocol kan ook worden gebruikt met de formele versies van deze software.

De volgende video beschrijft stap voor stap instructies voor het voorbereiden van de Caspase-structuur voor simulatie en het uitvoeren van een ascilica-onderzoek van dit eiwitachtige wilde type en gemodificeerde vormen. Om de geselecteerde eiwitgegevensbank of P D B-structuur op te halen, gebruikt u de vervolgkeuzelijst downloadbestanden en klikt u op P D B-indeling. Verwijder opmerkingen en connectiviteitsgegevens en plaats een T E R-kaart tussen afzonderlijke eiwitketens in het P D B-bestand.

Om het startmodel voor te bereiden, start u het T-LEAP-programma van het Amber Tools-pakket. Laad vervolgens het F F 14 S B-krachtveld om het eiwit met moleculaire mechanica en de parameters voor watermoleculen en atomaire ionen zoals natrium en chloride te beschrijven door de aangegeven commando's in de opdrachtregel in te voeren. Laad vervolgens het P D B-bestand en bouw coördinaten voor waterstofatomen die een object met de naam mol maken.

Controleer op interne inconsistenties die problemen kunnen veroorzaken met de opdracht check mol. Maak een oplosmiddeldoos rond het eiwit. Controleer vervolgens de totale lading door charge mol in te voeren en voeg tegenionen toe om het systeem te neutraliseren.

Maak het topblad P R M en het bestand van de coördinaat I N P C R D door de aangegeven opdracht in te voeren. Als u klaar bent, sluit u het T-lEAP-programma af. Voer de eerste fase van de energieminimalisatie uit om de posities van toegevoegde waterstofatomen en watermoleculen te optimaliseren, terwijl de eiwitcoördinaten worden vastgelegd door positionele beperkingen op zware atomen.

Voer het P M E M D-programma uit door de aangegeven opdracht in te voeren. Volg de vereiste argumenten terwijl ik gegevens beheer. P moleculaire topologie, krachtveldparameters en atoomnamen.

C begincoördinaten. O door de gebruiker leesbare loguitvoer R eindcoördinaten. REF, referentiecoördinaten voor positiebeperkingen.

Voer vervolgens de tweede fase van de energieminimalisatie uit zonder beperkingen om het hele systeem te optimaliseren met behulp van de ingangen van het aangegeven commando. Deze fase heeft tot doel het systeem te verwarmen van nul tot 300 kelvin. Voer het verwarmingsproces uit met positionele beperkingen op de eiwitatomen met 50 picoseconden bij constant volume door het gegeven commando als ingangen te gebruiken.

Volg het vereiste argument als X-coördinatensets die zijn opgeslagen over het moleculaire dynamicatraject. De volgende fase is nodig om de dichtheid van water aan te passen en de evenwichtstoestand van het eiwit te verkrijgen. Voer de equilibratie uit bij 300 kelvin gedurende 500 picoseconden bij constante druk zonder enige beperking met behulp van het aangegeven commando nadat het evenwicht met succes is bereikt.

Voer een productiemoleculaire dynamicasimulatie uit gedurende 10 nanoseconden of langer bij constante druk en genereer het trajectbestand voor daaropvolgende analyse van de eiwitstructuur met behulp van het aangegeven commando. De parallelle versie van het programma, P M E M D M P I of G P U versnelde versie P M E M D cuda kan worden gebruikt op computerclusters en supercomputers. Een lange moleculaire dynamicasimulatie kan in verschillende segmenten worden opgesplitst en sequentieel worden uitgevoerd.

In deze analyse werden wild type Caspase two en zijn Serine-384 alaninemutant onderzocht volgens de moleculaire dynamica modelleringsworkflow. De Serine-384 alaninesubstitutie veroorzaakte belangrijke conformatieverandering in het actieve siteresidu Arginine-378. Verder werd aangetoond dat de Serine-384 alaninesubstitutie de substraatherkenning beïnvloedde door de arginineresiduen op de actieve plaats die de castbasisactiviteit schaadden.

De sitegerichte mutagenese en biochemische tests toonden aan dat de Serine-384 alaninemutatie de enzymatische activiteit bij de verwerking van Caspase twee blokkeerde en de apoptose van kankercellen onderdrukte. De beschreven aanpak kan worden gebruikt om het effect van aminozuurmutaties en posttranslationele modificaties in caspase twee en andere caspase die betrokken zijn bij verschillende kankerziekten te beoordelen.