Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Het synaptonemale complex is een belangrijk onderdeel voor meiose. Om de functie ervan te bestuderen, moeten we ook de structuur begrijpen waarvoor superresolutiemicroscopie ongelooflijk nuttig is gebleken. We hebben ons protocol geoptimaliseerd om immunostained C.elegans gonad stabiel te bevestigen aan een coverslip die helpt om de resolutie te verbeteren tot 30 nanometer in intacte weefsels.

Het ontwerp van microscopie-experimenten met lokalisatie van één molecuul, de daaropvolgende analyse en ook de interpretatie van de gegevens kan behoorlijk uitdagend zijn en kan het beste samen met een expert worden opgezet. De procedure wordt gedemonstreerd door Ivana Cavka, een pre-doctorale fellow in het lab. De verwerving van de lokalisatiemicroscopiebeelden met één molecuul zal ook worden getoond door Rory Power, een optische ingenieur bij het MBL Imaging Center.

Begin met het plukken van leeftijdsgematchte Caenorhabditis elegans-wormen uit NGM-agarplaten. Breng de wormen over in een 30 microliter druppel EBTT op een coverslip. Was de wormen met nog eens 30 microliter EBTT.

Verwijder 30 microliter van de oplossing en laat een druppel van 30 microliter achter met de wormen op de coverslip. Gebruik een scalpelmes om de koppen van de wormen en/of de staarten af te snijden om de geslachtsklier te extruderen. Bij een succesvolle dissectie wordt gonadeweefsel volledig geëxtrudeerd buiten het wormlichaam.

Pipetteer 30 microliter van de fixatieve oplossing in de druppel van de ontlede wormen. Meng door te pipetteren en laat de monsters een minuut staan te fixeren. Stop de fixatie precies na één minuut door de wormen met een pipet van 20 microliter over te brengen op een PCR-buis gevuld met TBST.

Voer vervolgens een wasbeurt uit door de ontleedde monsters op een mini-benchtopcentrifuge te draaien. Zodra het supernatant is verwijderd, resuspenseer je de wormen in 200 microliter verse TBST. Na de laatste wasbeurt resuspenseer je de wormen in 200 microliter PBST en plaats je de PCR-buis op ijs.

Draai de ontleedde monsters op een mini benchtopcentrifuge en verwijder het supernatant. Voeg 50 tot 100 microliter koude methanol toe, meng door te pipetteren en laat de monsters 30 tot 60 seconden in methanol op ijs staan. Was de monsters tweemaal met 200 microliter PBST.

Nadat u de monsters hebt gedraaid en het supernatant hebt verwijderd, voegt u de blokkerende oplossing toe aan de monsters en houdt u deze gedurende 45 tot 60 minuten op kamertemperatuur. Verdun de primaire antilichamen tegen de werkoplossingen in de blokkerende buffer. Draai de monsters op een mini benchtopcentrifuge, verwijder de blokkerende oplossing en voeg 30 tot 50 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe.

Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de monsters aan het einde van de incubatie drie keer in PBST. Verdun de gelabelde Fab prime twee fragmenten tot de werkoplossingen in de blokkerende buffer.

Na de derde wasbeurt draait u de monsters naar beneden, verwijdert u het supernatant en voegt u 30 tot 50 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe. Plaats het monster in een donkere kamer en incubeer gedurende 30 minuten tot twee uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Was de monsters vervolgens drie keer met PBST gedurende vijf tot 15 minuten.

Draai de gekleurde monsters naar beneden en verwijder het supernatant. Voeg 50 microliter PBST toe en breng de gekleurde wormen over op een coverslip. Pipetteer 5,7 tot 6,3 microliter van de postfixatieoplossing op een poly-l-lycine coverslip.

Pipetteer de ontlede wormen in hetzelfde volume en breng over in de druppel fixatief op de poly-l-lysine coverslip. Bedek het monster met een kleine coverslip. Verwijder de overtollige vloeistof met een klein stukje filtreerpapier en bevestig het monster gedurende drie tot vijf minuten in een donkere kamer.

Vries de monsters in door ze op een aluminium blok in droogijs te plaatsen. Verwijder na ten minste 20 minuten de kleinere hoesjes met een scheermes. Dompel de coverslip in een conische buis van 50 milliliter met ijskoude PBS of methanol gekoeld bij min 20 graden Celsius gedurende ongeveer 10 seconden.

Plaats de dekselplaat in een putje van een plaat met zes putten gevuld met PBST-buffer. Haal de PBST uit de put, voeg verse PBST toe en laat het monster vijf minuten staan. Na het opnieuw wassen met PBST, laat u de monsters op vier graden Celsius staan totdat u in beeld bent gebracht.

Beoordeel vóór de beeldvorming de kwaliteit van de monstermontage onder een stereomicroscoop. Als u de op maat gemaakte monsterhouder gebruikt die hier wordt weergegeven, wikkelt u de magnetische ring met parafilm en bereidt u vervolgens een milliliter beeldbuffer voor. Neem een coverslip van de zes-well plaat.

Plaats hem in de op maat gemaakte houder en bevestig de coverslip in de houder met de met parafilm omwikkelde magnetische ring. Pipetteer voorzichtig de beeldbuffer in de kamer die is ontstaan door de magnetische ring bovenop het monster en sluit de kamer af met parafilm. Om het monster te monteren, voegt u één druppel dompelolie toe aan het doel van de schone olie.

Zonder lucht in de dompelolie te brengen, plaatst u de monsterhouder met het gemonteerde monster voorzichtig op het microscoopstadium. Gebruik het EMU-plug-invenster in MicroManager 2 om de piëzofase te verplaatsen totdat het signaal van de focusvergrendelingslaser wordt gedetecteerd bij het kwadrantfotodiode. Verkrijg een back focal plane-beeld bij lager vermogen met een laser op 640 nanometer excitatie om de afwezigheid van luchtbellen in de dompelolie te bevestigen.

Lokaliseer het geslachtsklierweefsel met behulp van de brightfield-verlichting. Met behulp van een verlichting met lage intensiteit op 640 nanometer, focus op het weefselgedeelte dat veel synaptonemale complexen bevat. Ga verder met het belichten van het monster bij hoge bestralingssterkte met verlichting op 640 nanometer gedurende ongeveer 30 seconden totdat een geschikte knippersnelheid is bereikt.

Verkrijg 200.000 frames met een belichtingstijd van 20 milliseconden met behulp van de multidimensionale acquisitietool in MicroManager 2. Stel ondertussen de UV-activering in met behulp van de activeringsoptie van de EMU-plug-in om de gewenste knippersnelheid te behouden. Het onderste vlak van meiotische kernen met synaptonemale complexen werd gevisualiseerd binnen een Caenorhabditis elegans gonad met behulp van HTP-3 en SYP-5 kleuring.

De chromosoomassen in de C-terminus van SYP-5 HA waren goed opgelost in alle drie de dimensies in synaptonemale complexen dicht bij de coverslip. De resolutie verslechtert echter in synaptonemale complexen op een afstand van vijf micrometer van de coverslip als gevolg van lichtverstrooiing en bolvormige aberraties. Beelden verkregen op verschillende piëzo-afstanden van de coverslip onthulden dat het afgebeelde weefsel niet verder dan twee micrometer van de coverslip mag zijn.

Het monstervoorbereidingsprotocol kan ook worden gebruikt met TauSTED-microscopie. Met de geoptimaliseerde monstervoorbereiding werden HTP-3 in de chromosoomassen en de C-termini van SYP-5 in het centrale gebied opgelost in frontaal zicht en licht gekantelde weergave. Om de beste resolutie te verkrijgen, moeten de geslachtsklieren nauw verbonden zijn met de coverslip om ervoor te zorgen dat de synaptonemale complexen zich niet verder dan twee micrometer van de coverslip bevinden.

We gebruiken dit protocol niet alleen voor lokalisatiemicroscopie met één molecuul, maar ook voor microscopie met gestimuleerde emissiedepletie. Het kan ook nuttig zijn voor andere superresolutiemicroscopietechnieken.