Snelle ontwikkeling van celtoestandsidentificatiecircuits met polytransfectie

Ons protocol maakt het gemakkelijker en sneller om relaties tussen biologische delen te begrijpen. We kunnen het gedrag van vele verhoudingsmetrische combinaties van onderdelen in één put testen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om de complexe relaties tussen circuitcomponenten uitgebreider te karakteriseren met een grotere experimentele efficiëntie dan conventionele benaderingen.

Deze methode is toepasbaar voor synthetische biologie en voor alle biologische vragen, het onderzoeken van gedragsveranderingen in een cel als reactie op verschillende niveaus van getransfecteerde genen waarbij de output kan worden gemeten via flowcytometrie. Begin met het voorbereiden van buizen voor elk DNA-aggregaat door 1,5 milliliter microcentrifugebuizen te reserveren die zijn gelabeld als geen kleurcontrole, mKO2-controle, TagBFP-controle, neongroene controle, alle kleurcontrole, poly-transfectiemix één en poly-transfectiemix twee. Voeg 36 microliter gereduceerd serummedium toe aan de no color control, mKO2 control, TagBFP control, neon green control en alle color control tubes, en voeg vervolgens 18 microliter gereduceerd serum medium toe aan elke poly-transfectie mix één en poly-transfectie mix twee buizen.

Voeg vervolgens 600 nanogram vulplasmide toe aan de controlebuis zonder kleur, 300 nanogram mKO2 en 300 nanogram vulplasmide aan de mKO2-kleurcontrolebuis en voeg 300 nanogram TagBFP en 300 nanogram vulplasmide toe aan de TagBFP-kleurcontrolebuis. Voeg aan de neongroene kleurcontrolebuis 300 nanogram constitutief neongroen en 300 nanogram vulplasmide toe en voeg vervolgens 100 nanogram van elke mKO2, TagBFP, constitutief neongroen en 300 nanogram vulplasmide toe aan de controlebuis voor alle kleuren. Voeg aan de polytransfectiemix één buis 150 nanogram mKO2, 75 nanogram reporter neongroen plasmide en 75 nanogram vulplasmide toe.

Voeg aan de polytransfectiemix twee buisjes 150 nanogram TagBFP, 75 nanogram L7Ae plasmide en 75 nanogram vulplasmide toe. Als u klaar bent, maakt u de transfectiemastermix in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter door 216 microliter gereduceerd serummedium te combineren met 9,48 microliter transfectiereagens. Meng goed door op en neer te pipetteren voordat je het opzij zet.

Voeg 1,58 microliter enhancer-reagens toe aan geen kleurcontrole, enkele kleurcontrole en alle kleurcontrolebuizen en voeg 79 microliter enhancer-reagens toe aan elke polytransfectiemixbuis. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren. Voeg 37,58 microliter transfectiemastermix toe aan de no color control, single color control en alle kleurcontrolebuizen en meng door krachtig te pipetteren.

Voeg vervolgens 18,79 microliter transfectiemastermix toe aan elke polytransfectiemixbuis en meng elke buis goed met krachtig pipetteren. Doseer de transfectiemengsels in de putten door 65,97 microliter van elke transfectiemix voor de no color, single color en alle kleurregelaars in de overeenkomstige putten te pipetteren, breng vervolgens 32,98 microliter van de polytransfectiemix één over in de polytransfectieput en verdeel de complexen effectief door de plaat snel maar voorzichtig in een strakke, Figurateer het patroon langs een plat oppervlak, pipetteer vervolgens 32,98 microliter van de polytransfectie, meng er twee in dezelfde polytransfectieput en draai de plaat op dezelfde manier. Incubeer cellen gedurende twee dagen.

Voer flowcytometrie uit om de fluorescentie van de transfectiemarkers en outputreporter voor elke cel uit te lezen. Een goed uitgevoerde co-transfectie, verschillend van de polytransfectie die in de video wordt getoond, toont een nauwe correlatie tussen TagBFP en EYFP, waarbij plasmiden tot expressie worden gebracht die gelijktijdig werden afgeleverd. Daarentegen vertoont een slecht uitgevoerde co-transfectie een slechte correlatie tussen de twee plasmiden.

Goed uitgevoerde polytransfectie toonde een goede dekking van de tweedimensionale ruimte en een goede compensatie van eventuele spectrale bloedingen tussen fluorescerende eiwitten. Polytransfectiegegevens met een laag aantal levende cellen waren moeilijk onder te verdelen in voldoende bakken met een voldoende aantal cellen in elke bak voor analyse. Een polytransfectie met slechte transfectie-efficiëntie resulteerde in een schaarse dekking van de tweedimensionale ruimte voor analyse.

De effectieve DNA-verhouding op outputexpressie werd getest door een repressoreiwit, L7Ae met mKO2, en een outputeiwit, neongroen met TagBFP, in afzonderlijke transfectiemengsels te plaatsen. Neongroene expressie werd vervolgens gemonitord op verschillende niveaus van mKO2 en TagBFP. Co-transfectie en poly-transfectie resultaten werden vergeleken voor dit circuit.

Resultaten van 11 individuele co-transfecties die de eerder getoonde DNA-delen combineerden, werden verzameld in een enkele dataset en vergeleken met de polytransfectiegegevens. Vergelijking van de dosisresponscurven van L7Ae die de outputreporter onderdrukten, toonde aan dat het mediane outputniveau per bin zeer vergelijkbaar was tussen de co-transfectie- en polytransfectiegegevens. Een succesvolle toepassing van polytransfectie werd aangetoond voor het optimaliseren van een celtypeclassificatie.

Het micro-RNA-21 dat aanwezig is in HeLa-cellen en niet-HEK-cellen werkt om de expressie van BM3R1 neer te halen omdat BM3R1 de productie van de circuituitgang mKO2 onderdrukt. Wanneer micro-RNA 21 in een cel aanwezig is, wordt mKO2-expressie ingeschakeld. De hoeveelheid Gal4-VP16 stemt mKO2-expressie af op lage niveaus van BM3R1.

Elk circuitonderdeel werd samen geleverd met een andere fluorescerende marker. Deze polytransfectie kwantificeert hoeveel van elke circuitcomponent elke cel heeft ontvangen. mKO2 wordt geproduceerd in MIR21 en produceert HeLa-cellen, maar niet in HEK-cellen.

mKO2-uitgang werd geanalyseerd na het leveren van deze circuitcomponenten in afzonderlijke transfectiemengsels met verschillende fluorescerende reporters om de hoeveelheid van elke circuitcomponent aan te geven die door een bepaalde cel werd ontvangen. Deze sub-sampling voorspelde dat bij deze verhouding het co-getransfecteerde circuit een specificiteit van 91%, 62% sensitiviteit en 77% nauwkeurigheid had bij het classificeren van HEK293 versus HeLa-cellen. Het meest voorkomende pijnpunt in dit protocol is een gebrek aan een nauwe correlatie binnen elke transfectiemix.

Dus vergeet niet om de transfectiebuizen direct na het toevoegen van het enhancer-reagens krachtig te mengen en vervolgens voorzichtig te zijn met het mengen en pipetteren van de transfectiebuizen nadat de lipidebevattende transfectiemix is toegevoegd De genetische componenten in deze procedure kunnen worden vervangen door andere genetische componenten om vragen over hun functionerende prestaties in verschillende omgevingen te beantwoorden. Deze methode heeft snel genetische circuits ontwikkeld, zoals celclassificaties, feedback- en feedforward-controllers, bi-stabiele motieven en nog veel meer.