Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen
April 14th, 2015
Sinds de ontdekking van het groene fluorescente eiwitgen, hebben fluorescente eiwitten invloed gehad op de moleculaire celbiologie. Dit protocol beschrijft hoe expressie van verschillende fluorescente eiwitten door genetische manipulatie wordt gebruikt voor het barcoden van individuele cellen. De procedure maakt het mogelijk om verschillende populaties in een cellenmengsel te volgen, wat ideaal is voor multiplextoepassingen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om zoogdiercellen fluorescent te barcoden om multiplexed high throughput biologische assays te verbeteren die afhankelijk zijn van verschillende fluorescente uitlezingen. Om dit te doen, worden retrovirale deeltjes gebruikt om fluorescente eiwitten stabiel in zoogdiercellen tot expressie te brengen, waardoor ze worden gebarcodet. Vervolgens wordt fluorescente geactiveerde celsortering uitgevoerd om klonale gebarcodete populaties te verkrijgen.
De klonale populaties worden vervolgens versterkt, gecombineerd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie om te bevestigen dat ze van elkaar kunnen worden onderscheiden en dus gelijktijdig kunnen worden gebruikt. Ten slotte worden de gebarcodete cellijnen getransduceerd met een getagd assay. Eiwitten en biologische activiteit worden gemonitord met behulp van fluorescente kanalen die verschillen van de gebarcodete kanalen.
De resultaten tonen de bruikbaarheid van fluorescente bar coating van zoogdiercellen voor multiplexed toepassingen in een high throughput-omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die zorgvuldige kalibratie van antilichamen of kleurstoffen vereisen, is dat eenmaal genetisch gebarcodete cellijnen zijn gevestigd, ze geen verdere manipulatie vereisen en omdat het eiwit van belang lange tijd tot expressie wordt gebracht, worden ze verder gebruikt voor biologische aanpassingen. Het koppelen van fluorescente genetisch gebarcodete cellijnen met oppervlakte-assays stelt ons in staat om biologische functies of effecten onafhankelijk te onderzoeken in een hydro doorvoerformaat.
In ons voorbeeld gebruiken we fluorescente genetische bar coating om de splitsing van verschillende virale substraten multiplexing te monitoren. De assay kan verder worden benut om de mechanismen die betrokken zijn bij splitsing te onderzoeken en voor high throughput drug discovery. De dag voor transfectie zaai je een 10 centimeter plaat met 2,5 keer 10 tot de zesde Phoenix GP cellen in DMEM met 10%FBS.
Deze verpakkingscellijn drukt stabiel gag en pole eiwitten uit voor retrovirale deeltjevorming in trance. Op de dag van de transfectie, gebruik een brightfield microscoop om de cellen te onderzoeken. De cellen moeten gezond zijn en aan de plaat hechten in een monolaag om te worden gebruikt voor transfectie.
Bereidt vervolgens het DNA transfectiemengsel tot 125 microliters serumvrij DMEM. Voeg drie microgram van het vesiculair stomatitis virus envelop glycoproteïne vector, P-C-I-V-S-V-G, en drie microgram van transfer vector dragend het fluorescente eiwit gen van belang toe. Voeg 15 microliters van polyetheramine transfectiereagens toe en meng om virale deeltjes te verkrijgen die verschillende fluorescente eiwitmarkeringen dragen. Voer elke transfectie onafhankelijk uit met de marker van keuze om dit te doen.
Incubeer elk mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de incubatie, transfecteer door het mengsel aan de cellen toe te voegen. Druppelsgewijs en vervolgens de platen gedurende 37 graden Celsius incuberen. Optioneel, na 24 uur, vervang het medium met zeven milliliter vers medium.
Hoewel dit de gezondheid van de cellen kan verbeteren, kan het de virale belasting in het supernatant verminderen. 48 uur na transfectie gebruikt u een pipet om het supernatant, dat de virusdeeltjes bevat, over te brengen naar een 10 milliliter spuit. Voorzien van een 0,20 micromolair polytetrafluorethyleen filter om de zuiger in te drukken om het filtraat in twee milliliter micro centrifugeerbuisjes te doseren.
Stel een aliquot van twee milliliters aan de kant voor onmiddellijk gebruik. Plaats de resterende virale snat en aliquoten op ijs en breng ze over naar min 80 graden Celsius totdat ze worden gebruikt 24 uur voor transductie in elke put van een zes putten plaat zaai je 2,0 tot 3,0 keer 10 tot de vijfde adherente cellen hier 2 9 3 T cellen worden de volgende dag gebruikt. Om de adherente cellen te transduceren, verwijdert u het bestaande media van de plaat.
Voeg vijf microgram per milliliter van polybrein toe aan de twee milliliter van de eerder verzamelde virale sine, en voeg het mengsel voorzichtig toe aan de cellen. Sluit de platen met parfum. Plaats vervolgens de platen in een hangende emmer.
Centrifugeer centrifugeer gedurende 120 minuten bij 1500 keer G bij 32 graden Celsius. Na het spinnen, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na 24 uur vervangt u het cellenmedium ten minste 72 uur.
Na transductie. Bereid de getransduceerde cellen voor om te analyseren door middel van flowcytometrie om de percentage transductie te kwantificeren. Ten eerste, met behulp van een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle, zorg ervoor dat de poorten correct zijn ingesteld in de juiste kanalen.
Stel de parameterkanaalspanning in zodat de negatieve populatie onder de waarde van 10 tot de derde op elke fluorescente as van belang is. Stel vervolgens de poorten voor positieve fluorescentie in als gebeurtenissen die voorbij die van de negatieve controle verschijnen. Gebruik vervolgens de getransduceerde cellen om het percentage positief voor het specifieke fluorescente kanaal te bepalen.
Sorteer de cellen in 15 milliliter conische buisjes die een milliliter van 100%FBS bevatten. Draai vervolgens de gesorteerd populaties in een hangende emmer. Rotor centrifugeer bij 524 keer G bij 32 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Na het spinnen, resuspendeer de cellen in een milliliter vers medium, zaai vervolgens twee keer 10 tot de zes cellen in twee milliliter DMEM op een zes centimeter plaat. Bij deze concentratie is de confluentie minder dan 60% en zal groei en deling gedurende ten minste twee dagen mogelijk zijn. Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende enkele dagen om tijd te geven voor amplificatie.
Klonale populaties kunnen worden gegenereerd uit de oorspronkelijk getransduceerde of de gesorteerd cellen. Sortering van strakke populaties op basis van gekozen fluorescentie in plaats van individuele klonen in dit stadium zorgt voor een back-up populatie voor toekomstige selectie. Als dat nodig is, stel de poorten voor sortering in op basis van populaties van belang, zorg ervoor dat de poorten ten minste een logaritmische schaal uit elkaar staan. Om onderscheidbare populaties te verkrijgen, gebruikt u een geautomatiseerde cell depositie unit om enkele cellen in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het fluorescent barcoderen van zoogdiercellen om multiplexed high-throughput biologische assays te verbeteren. Door retrovirale deeltjes te gebruiken om distincte fluorescente eiwitten stabiel tot expressie te brengen, kunnen onderzoekers individuele celpopulaties in een mengsel volgen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Moleculaire Celbiologie
- Cellulaire Assays
- Fluorescente Beeldvorming
Achtergrond
- Fluorescente eiwitten hebben de moleculaire biologie gerevolutioneerd sinds hun ontdekking.
- Barcoderen maakt het mogelijk om distincte celpopulaties te volgen.
- Deze techniek is vooral nuttig in multiplexed toepassingen.
- Flow cytometry wordt gebruikt om distincte populaties te analyseren en te bevestigen.
Doel van het onderzoek
- Om zoogdiercellen fluorescent te barcoden voor verbeterde assaymogelijkheden.
- Om gelijktijdige analyse van meerdere celpopulaties mogelijk te maken.
- Om biologische activiteit te monitoren met behulp van distincte fluorescente kanalen.
Gebruikte methoden
- Stabiel tot expressie brengen van fluorescente eiwitten via retrovirale deeltjes.
- Fluorescente geactiveerde celsortering om clonale populaties te isoleren.
- Amplificatie en combinatie van clonale populaties.
- Flow cytometry voor analyse van barcodede cellijnen.
Belangrijkste resultaten
- Clonale barcodede populaties kunnen van elkaar worden onderscheiden.
- Barcoded cellijnen kunnen gelijktijdig in assays worden gebruikt.
- Distincte fluorescente uitlezingen verbeteren de analyse van biologische activiteit.
- Succesvolle transductie van barcodede cellijnen met getagde assays.
Conclusies
- Fluorescent barcoden is effectief voor het volgen van zoogdiercellen.
- Deze methode verbetert de mogelijkheden van high-throughput assays.
- Distincte fluorescente kanalen maken een uitgebreid monitoring van biologische processen mogelijk.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Fluorescent genetic barcoding enables multiplexed high-throughput screening by creating stably labeled cell populations that require no further manipulation after establishment. This approach enhances assay power through concurrent analysis of distinct biological functions using flow cytometry-resolvable fluorescent channels. The method supports target de-risking and predictive confidence in early discovery by allowing parallel evaluation of multiple substrates or promoters within a unified experimental system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous tracking of multiple viral substrate cleavage events in barcoded populations.
- Operational Value: Provides stable, long-term fluorescent labeling that eliminates need for repeated dye calibration or antibody titration in multiplex formats.
- Predictive Value: Supports lead identification by allowing direct comparison of assay outcomes across distinct barcoded lines under identical conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates clonal cell lines with tight fluorescence patterns suitable for standardized assay development and reagent titration.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems compatible with cell-based assays and surface protein monitoring via distinct fluorescent readouts.
- Scalability: Supports amplification and cryopreservation of barcoded stocks for reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates monitoring of biological activity in secretory pathways using tag-coupled assays transduced into barcoded cells.
- Mechanistic De-risking: Allows dissection of cleavage machinery involvement (e.g., HIV envelope, dengue virus) through parallel substrate testing in multiplex format.
- Predictive Confidence: Enables decoding of assay results by linking fluorescent barcodes to specific biological outputs via flow cytometry gating strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reusable platform for hypothesis testing, assay standardization, and quantitative phenotypic screening prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation through multiplexed monitoring of protein cleavage and translocation events.
- Screening: Delivers assay-ready clonal populations with distinguishable fluorescence for high-throughput compound or substrate screening.
- Analytics: Provides multiplex-capable readouts via flow cytometry that enable statistical comparison of biological activity across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase barcoding to preclinical continuity through stable expression of assay-coupled reporters in mammalian cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a frozen, thaw-and-use resource that enhances reproducibility and reduces technical variability across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct comparison of multiple biological functions in a single experimental system.
- Operational Value: Increases throughput and reagent efficiency through multiplexing, reducing per-assay cost and hands-on time.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by generating concordant multi-parametric data from isogenic barcoded lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, reproducible outputs across diverse target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retroviral transduction, fluorescent protein selection, and flow cytometry gating for multiplex analysis.
- Dependent on access to biosafety-level equipment for viral production and FACS sorting of clonal populations.
- Necessitates standardization of fluorescence compensation and channel separation to ensure distinguishable barcodes across experiments.
- Involves validation of clonal purity and fluorescence stability over extended culture periods to maintain barcode integrity.
- Limited by spectral overlap constraints; requires careful selection of fluorescent proteins with non-overlapping excitation/emission profiles for multiplex clarity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
Preparation of Mammalian Cells, Viral Production and Transduction for Genetic Barcoding
4:59
Selection and Amplification of Genetically Barcoded Cells
6:28
Obtaining Clonal Populations of Genetically Barcoded Cells at Different Intensities
8:51
Adapt Genetically Barcoded Cell Lines to the Biolgical Application of Choice
10:52
Results: A Multiplex Analysis of Cleavage of the HIV Envelope and Dengue Virus pr-M Boundary Proteins
12:14
Conclusion
