Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Het algemene doel van het volgende experiment is om zoogdiercellen fluorescent te barcoden om multiplexed high throughput biologische assays te verbeteren die afhankelijk zijn van verschillende fluorescente uitlezingen. Om dit te doen, worden retrovirale deeltjes gebruikt om fluorescente eiwitten stabiel in zoogdiercellen tot expressie te brengen, waardoor ze worden gebarcodet. Vervolgens wordt fluorescente geactiveerde celsortering uitgevoerd om klonale gebarcodete populaties te verkrijgen.

De klonale populaties worden vervolgens versterkt, gecombineerd en geanalyseerd door middel van flowcytometrie om te bevestigen dat ze van elkaar kunnen worden onderscheiden en dus gelijktijdig kunnen worden gebruikt. Ten slotte worden de gebarcodete cellijnen getransduceerd met een getagd assay. Eiwitten en biologische activiteit worden gemonitord met behulp van fluorescente kanalen die verschillen van de gebarcodete kanalen.

De resultaten tonen de bruikbaarheid van fluorescente bar coating van zoogdiercellen voor multiplexed toepassingen in een high throughput-omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die zorgvuldige kalibratie van antilichamen of kleurstoffen vereisen, is dat eenmaal genetisch gebarcodete cellijnen zijn gevestigd, ze geen verdere manipulatie vereisen en omdat het eiwit van belang lange tijd tot expressie wordt gebracht, worden ze verder gebruikt voor biologische aanpassingen. Het koppelen van fluorescente genetisch gebarcodete cellijnen met oppervlakte-assays stelt ons in staat om biologische functies of effecten onafhankelijk te onderzoeken in een hydro doorvoerformaat.

In ons voorbeeld gebruiken we fluorescente genetische bar coating om de splitsing van verschillende virale substraten multiplexing te monitoren. De assay kan verder worden benut om de mechanismen die betrokken zijn bij splitsing te onderzoeken en voor high throughput drug discovery. De dag voor transfectie zaai je een 10 centimeter plaat met 2,5 keer 10 tot de zesde Phoenix GP cellen in DMEM met 10%FBS.

Deze verpakkingscellijn drukt stabiel gag en pole eiwitten uit voor retrovirale deeltjevorming in trance. Op de dag van de transfectie, gebruik een brightfield microscoop om de cellen te onderzoeken. De cellen moeten gezond zijn en aan de plaat hechten in een monolaag om te worden gebruikt voor transfectie.

Bereidt vervolgens het DNA transfectiemengsel tot 125 microliters serumvrij DMEM. Voeg drie microgram van het vesiculair stomatitis virus envelop glycoproteïne vector, P-C-I-V-S-V-G, en drie microgram van transfer vector dragend het fluorescente eiwit gen van belang toe. Voeg 15 microliters van polyetheramine transfectiereagens toe en meng om virale deeltjes te verkrijgen die verschillende fluorescente eiwitmarkeringen dragen. Voer elke transfectie onafhankelijk uit met de marker van keuze om dit te doen.

Incubeer elk mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de incubatie, transfecteer door het mengsel aan de cellen toe te voegen. Druppelsgewijs en vervolgens de platen gedurende 37 graden Celsius incuberen. Optioneel, na 24 uur, vervang het medium met zeven milliliter vers medium.

Hoewel dit de gezondheid van de cellen kan verbeteren, kan het de virale belasting in het supernatant verminderen. 48 uur na transfectie gebruikt u een pipet om het supernatant, dat de virusdeeltjes bevat, over te brengen naar een 10 milliliter spuit. Voorzien van een 0,20 micromolair polytetrafluorethyleen filter om de zuiger in te drukken om het filtraat in twee milliliter micro centrifugeerbuisjes te doseren.

Stel een aliquot van twee milliliters aan de kant voor onmiddellijk gebruik. Plaats de resterende virale snat en aliquoten op ijs en breng ze over naar min 80 graden Celsius totdat ze worden gebruikt 24 uur voor transductie in elke put van een zes putten plaat zaai je 2,0 tot 3,0 keer 10 tot de vijfde adherente cellen hier 2 9 3 T cellen worden de volgende dag gebruikt. Om de adherente cellen te transduceren, verwijdert u het bestaande media van de plaat.

Voeg vijf microgram per milliliter van polybrein toe aan de twee milliliter van de eerder verzamelde virale sine, en voeg het mengsel voorzichtig toe aan de cellen. Sluit de platen met parfum. Plaats vervolgens de platen in een hangende emmer.

Centrifugeer centrifugeer gedurende 120 minuten bij 1500 keer G bij 32 graden Celsius. Na het spinnen, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na 24 uur vervangt u het cellenmedium ten minste 72 uur.

Na transductie. Bereid de getransduceerde cellen voor om te analyseren door middel van flowcytometrie om de percentage transductie te kwantificeren. Ten eerste, met behulp van een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle, zorg ervoor dat de poorten correct zijn ingesteld in de juiste kanalen.

Stel de parameterkanaalspanning in zodat de negatieve populatie onder de waarde van 10 tot de derde op elke fluorescente as van belang is. Stel vervolgens de poorten voor positieve fluorescentie in als gebeurtenissen die voorbij die van de negatieve controle verschijnen. Gebruik vervolgens de getransduceerde cellen om het percentage positief voor het specifieke fluorescente kanaal te bepalen.

Sorteer de cellen in 15 milliliter conische buisjes die een milliliter van 100%FBS bevatten. Draai vervolgens de gesorteerd populaties in een hangende emmer. Rotor centrifugeer bij 524 keer G bij 32 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Na het spinnen, resuspendeer de cellen in een milliliter vers medium, zaai vervolgens twee keer 10 tot de zes cellen in twee milliliter DMEM op een zes centimeter plaat. Bij deze concentratie is de confluentie minder dan 60% en zal groei en deling gedurende ten minste twee dagen mogelijk zijn. Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius gedurende enkele dagen om tijd te geven voor amplificatie.

Klonale populaties kunnen worden gegenereerd uit de oorspronkelijk getransduceerde of de gesorteerd cellen. Sortering van strakke populaties op basis van gekozen fluorescentie in plaats van individuele klonen in dit stadium zorgt voor een back-up populatie voor toekomstige selectie. Als dat nodig is, stel de poorten voor sortering in op basis van populaties van belang, zorg ervoor dat de poorten ten minste een logaritmische schaal uit elkaar staan. Om onderscheidbare populaties te verkrijgen, gebruikt u een geautomatiseerde cell depositie unit om enkele cellen in