Name: Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Leer hoe je fluorescerende barcodes in zoogdiercellen introduceert via retrovirale transductie voor multiplexed high-throughput assays. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van meerdere celpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zouden graag Dr Garry Nolan danken aan de Stanford University voor het verstrekken van de Phoenix GP inpakcellijn voor de productie van retrovirale deeltjes. Wij danken Dr Roger Tsien aan de Universiteit van Californië in San Diego voor het verstrekken van td tomaat. We willen ook graag naar de San Diego State University flowcytometrie Core Facility bedanken voor hun service en hulp.

1. Voorbereiding van zoogdiercellen, Viral Productie en Transduction voor Genetische barcodes <ol><li> Plaat 2,5 x 10 6 hechtende cellen in een 10 cm plaat (of ongeveer 50-60% confluentie) één dag voor transfectie in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Voor retrovirale productie gebruik inpakcellijn-lijn van keuze, zoals Phoenix-GP (een soort geschenk van Gary Nolan, Stanford University). OPMERKING: De inpakcellijn stabiel uitdrukt Gag en Pol eiwitten voor retrovirale vorming deeltje in trans. Controleer cellen gezond en gehecht aan de plaat in een monolaag vóór transfectie. </li><li> 24 uur later, de voorbereiding van het DNA transfectie mengsel. <ol><li> 125 ul serumvrij DMEM voeg 3 ug Vesiculaire stomatitis envelop glycoproteïne vector (pCI-VSVG) en 3 ug overdracht vector die het fluorescerende proteïne gen van interesse. Mengen en voeg 15 ul van polyethylimine (2 mg / ml). </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en voeg aan cellen druppelsgewijs. OPMERKING: polyethylimine toegevoegd aan het homogene mengsel DNA transfectie reagens voor de vorming van polyplexen. Om virale deeltjes te verkrijgen dragen verschillende fluorescent eiwit markers, voeren elke transfectie zelfstandig met de markering van keuze. Bedenk dat de retrovirale vector overdracht is ongeveer 7 kb in lengte en kan niet worden verpakt als boven 10 kb. </li></ol></li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C. Om virusproductie plaats platen verhogen bij 30 ° C of 32 ° C plaats. OPMERKING: 24 uur na transfectie media kunnen worden vervangen door 7 ml vers medium, en hoewel dit gezondheid cel kan verbeteren kan viral load in het supernatant af. </li><li> 48 uur na transfectie verzamel de bovenstaande vloeistof die virusdeeltjes en filter met een 0,45 pm polytetrafluoretheen filter. Gebruik vers verzameld viraal supernatant voor transductie. Othders houden supernatant in aliquots bij -80 ° C en voorkomen vries-dooi. Bedenk dat virale titer waarschijnlijk tot 50% bij elke invriezen ontdooicyclus zal afnemen. </li><li> Plaat cellijn naar keuze 24 uur voorafgaand aan transductie als aanhanger, of onmiddellijk vóór transductie als niet-klevende. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 hechtende cellen (hier Huh 7.5.1 en HEK 293T) of 5,0 x 10 5 tot 1 x 10 6 niet-hechtende cellen (hier SupT1) per putje in een 6-wells plaat. OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kalibreren van het aantal cellen voorafgaand aan transductie te worden gezaaid, vooral zo voor hechtende cellen, zodat de cellen bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 60% op het moment van transductie. </li><li> Voeg 5 ug / ml polybreen (hexadimethrene bromide) te gezaaide cellen en voeg eerder verzamelde virale supernatant tot ongeveer 20-40% infectie (hier 2 ml) te verkrijgen. OPMERKING: De MOI of percentage van de infectie is meestal arbitrair, zoals sorteren zal toelaten om elke subpopulat versterkenion cellen. Uiteraard, een hoger percentage van de infectie vergemakkelijkt en versnelt het proces van versterking. </li><li> Transduceren cellen door centrifugeren in een hangende bucket rotor bij 1500 xg gedurende 120 min bij 32 ° C. Resuspendeer niet-hechtende cellen met vers medium voorafgaande aan incubatie. Voor hechtende cellen, te vervangen door vers medium 24 uur na transductie. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de platen centrifugeerden met parafilm verzegelen om te voorkomen dat morsen over. Genetisch barcode diversiteit cel te verhogen, transduceren cellen met virale deeltjes dragen verschillende fluorescerende eiwitten (verkregen uit stap 1.4). Bij het kiezen van fluorescente merkers, zorg ervoor dat ze compatibel zijn met de instrumentatie en ze hebben onderscheiden fluorescerende parameters. </li></ol> 2. Selectie en Versterking van genetisch barcode Cellen <ol><li> Analyseer getransduceerde zoogdiercellen door flowcytometrie ten minste 72 uur na transductie op het kortingspercentage van transductie te kwantificeren. Gebruik een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle. OPMERKING: het sorteren wordt gebruikt om individuele barcode celpopulaties, een hoog percentage van de initiële transductie te zuiveren, terwijl het niet nodig is, moet versnellen het proces van versterking. </li><li> Gebruik de cel sorter keuze aan de cellen die het eiwit van interesse tot expressie te verkrijgen. <ol><li> Daartoe zorgen de poorten goed zijn ingesteld in de juiste kanalen. <ol><li> Om dit te doen gebruiken dezelfde naïeve cellijn als negatieve controle en stel de parameter / kanaal spanning, zodat de negatieve bevolking is lager dan de waarde van 10 3 op elke TL-as. Bepaal venstertijd voor positieve fluorescentie als gebeurtenissen die boven die van de negatieve controle voor elk fluorescerende kanaal verschijnen. </li></ol></li><li> Wees ervan bewust dat elk instrument kan variëren en de juiste spanning voor het bepalen van gating moet dienovereenkomstig worden aangepast, het maken van positieve en negatieve controles imperatief in elk experimental setup. <ol><li> Voor fluorescentie detectie in deze experimentele opstelling te kunnen gebruiken de FITC kanaal (530/30 band pass filter voorafgegaan door een 502 lange pass filter) voor eGFP, de PE-kanaal (585/42 band pass filter voorafgegaan door een 556 lange pass filter) voor td Tomaat , en het APC-kanaal (660/20 band pass filter) voor E2 Crimson. OPMERKING: De 488 nm laser boeit eGFP en td Tomaat terwijl E2 Crimson wordt opgewekt door de 633 nm laser. </li></ol></li></ol></li><li> Sorteren in 15 ml conische buizen met 1 ml 100% FCS. Opmerking: Het proces sorteren fluorescente celpopulaties niet verplicht als een direct doorgaan met de soort van individuele klonen (zie hieronder). Sorteren strakke populatie op basis van gekozen fluorescentie zorgt voor een back-up bevolking voor de toekomstige selectie van individuele klonen. Houd in gedachten dat individuele cellen zijn soms moeilijk om te groeien, terwijl een grote populatie van cellen gemakkelijk kunnen worden bevroren, en vervolgens ontdooid en versterkt in een later stadium. </li><li> Spin onderaan de gesorteerde populaties hangend bucket rotor centrifuge bij 524 g bij 32 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer in 1 ml vers medium en opnieuw cellaag zodat cel confluentie is dan 60% groei en deling wacht ten minste twee dagen. <ol><li> Bijvoorbeeld plaat hechtende cellen op ongeveer 3 x 10 5 cellen in 2 ml medium per putje in een 6-wells plaat en 2 x 10 6 cellen in 2 ml medium in een 6 cm plaat. Gebruik DMEM voor hechtende cellen en RPMI voor niet-hechtende cellen (of enige drager indien nodig). Plaats cellen uitgeplaat in een incubator bij 37 ° C gedurende enkele dagen amplificatie mogelijk. </li></ol></li></ol> 3. Zorg voor klonale populaties van genetisch barcode cellen op verschillende intensiteiten <ol><li> Verkrijgen klonale populaties van cellen oorspronkelijk getransduceerde (stap 1.7) of de gesorteerde populatie (stap 2.3). LET OP: Dit zal zorgen voor gelijke of gelijkwaardige niveau van fluorescerend eiwit expressie onder al de cels binnen de populatie (een strakke populatie met een kleine CV gemiddelde fluorescentie-intensiteit van 40%). <ol><li> Daartoe soort enkele cellen in 96-well platen met een geautomatiseerde cel neerslageenheid (ACDU). Stel poorten voor het sorteren volgens de bevolking van belang. Zorgen poorten zijn ingesteld ten minste één log-schaal uit elkaar te onderscheiden populatie te verkrijgen bij het kiezen van cellen op verschillende fluorescentie-intensiteiten. Voor de hier getoonde procedure, maken gebruik van dezelfde flowcytometrie experimentele opgezet als de ene in stap 2.2 beschreven. </li></ol></li><li> Amplify individuele klonen in een incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 2 weken. Door het proces van amplificatie analyseren de cellen onder de microscoop opdat groeiende bevolking ontstaan ​​uit afzonderlijke cellen en niet uit meer dan één. LET OP: Vergeet niet dat de sorter één cel per putje zal leggen op het gemiddelde, en terwijl sommige putten elke cel niet kan hebben helemaal niet, anderen kunnen er meer zijn. <ol><li> Om ervoor te zorgen dat een povolking ontstaat uit één cel alleen, uiterst voorzichtig met de plaat en nooit verstoren de putten door pipetteren. Bekijk de plaat, goed door goed, onder de microscoop. OPMERKING: Terwijl de individuele cellen kan soms moeilijk te identificeren, als ze eenmaal beginnen te delen zullen ze gemakkelijk te herkennen zijn. </li><li> Wees ervan bewust dat vaak cellen &#39;klomp&#39; langs de randen. Gooi die putten waar meerdere klonale populaties kunnen worden waargenomen en die bewaren, dat een strakke bevolking. OPMERKING: Het is raadzaam om deze over te dragen in grotere platen voor versterking. </li></ol></li><li> Zeef de vermoedelijke klonale populaties door deze te analyseren door flowcytometrie. Vergelijk ze een negatieve controle die dezelfde flowcytometrie experimentele opstelling. <ol><li> Analyseer slechts een percentage van het monster en houden de rest als backup. Kies de meest duidelijk omschreven populaties op basis van gemiddelde intensiteit en de dichtheid van de bevolking. Versterken ze als dat nodig is of voorraden te bevriezen inbevriezing medium met 20% glycerol bij -80 ° C gedurende korte perioden of vloeibare stikstof langer. LET OP: Vergeet niet dat een &#39;echte&#39; klonale populatie een zeer strakke fluorescentie patroon zou moeten hebben. </li></ol></li></ol> 4. Zorg Multiplexing Mogelijkheden voor high throughput screening (HTS) <ol><li> Combineer zoveel afzonderlijke klonale populaties nodig die verder kunnen worden gebruikt in een multiplex formaat. Kies klonen met onderscheidbare absorptie / emissie spectra en / of verschillende intensiteiten. Als een 96-well plaat formaat wordt gebruikt, die geschikt is voor HTS, zaad 50.000 cellen in 200 ul per putje. OPMERKING: Houd er rekening mee dat het aantal cellen is slechts een schatting en kunnen veranderen op basis van cell-type en of het aanhangend of niet. </li><li> Analyseer het monster met behulp van flowcytometrie zodat elk onafhankelijk vastgestelde fluorescerende cellijnen kunnen worden onderscheiden van elkaar. Voorafgaand aan de analyse te maken negatieveen enkele kleur controles om de parameters en compensatie waarden in te stellen. NB: Het instellen van de parameters om een ​​duidelijk onderscheid van de gemengde populatie zal hen in staat stellen verder te worden gebruikt in een multiplex-formaat. </li></ol> 5. Pas Genetisch Barcoded cellijnen aan de Biologische Toepassing van Keus <ol><li> Transduceren vastgesteld genetisch barcode cellijnen met virale deeltjes die de testelementen keuze bevatten, zoals hier beschreven Stolp et al., 2013 59. Bedenk dat de test van keuze een extra en onderscheidbaar fluorescerend kanaal moet innemen en dus moet worden overgebracht naar de juiste barcode cellijn. OPMERKING: Elke barcode cellijn kan een andere test te dragen. </li><li> Sorteer genetisch fluorescerende barcode cellen voor degenen die analyse-elementen bevatten. OPMERKING: Assay elementen kunnen worden gemanipuleerd gekoppeld aan een label of fluorescerend eiwit (als een fusie of door een interne ribosoom binnenkomstplaats) fof eenvoudig opsporing door western blotting, flowcytometrie of microscopie. Het systeem gebruikt in dit protocol is gebaseerd op HA epitoop oppervlakte-expressie alleen, of met extra FLAG epitoop expressie. <ol><li> Vlekken de klonale populaties die de assay met HA en APC-fluorescent gekoppelde antilichamen. Vervolgens analyseren de klonale populaties met anti-FLAG en FITC-geconjugeerd antilichaam kleuring. </li><li> Om terug volgen de assay geanalyseerd of &quot;decoderen&quot; van de bevolking in het juiste kanaal waarbij de kenmerkende genetisch barcode cellijnen kunnen worden onderscheiden. Hier, decoderen de aard van het substraat door het analyseren in het PE kanaal TD Tomato detectie. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, e...

Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies 1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen 10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) 14, de ontdekking van nature voorkomende fluorescerende eiwitten van andere cnidarians, vooral koralen, sterk toegenomen het aantal bestaande fluorescerende eiwitten met onderscheiden excitatie / emissie spectra. Deze, samen met de introductie van mutaties in de genen 15-19, have verder uitgebreid de mogelijkheden, het verkrijgen van een ware palet van fluorescente proteïnen beschikbaar voor wetenschappers die microscopie benutten flowcytometrie andere fluorescentie gebaseerde technologieën voor hun onderzoek. Daarnaast hoewel onafhankelijk de ontwikkeling van retrovirale technologie drastisch vergemakkelijkt de stabiele expressie van ectopische genetische informatie in zoogdiercellen 20-23. Het is dus niet verwonderlijk dat deze technologie is gebruikt om genen van fluorescerende eiwitten over in een groot aantal celtypen en weefsels 24-28 of voor de productie van transgene dieren 29-31. Na de aard van retrovirussen, wordt de genetische informatie van het ectopische fluorescerend eiwit geïntroduceerd in het genoom van de cel 32 en de cel wordt fluorescente &#39;voor ever&#39;. Deze woning is toegestaan ​​volgen van lot van de cel, of van een enkele cel binnen een populatie van cellen. De nu fluorescerende cel heeft dus Acquired eigen Biosignatuur en kan worden gedefinieerd als barcode. Zijn unieke Biosignatuur identificeert zich van andere cellen, en belangrijker nog, onderscheidt het zich van cellen genetisch gemanipuleerd om verschillende fluorescerende eiwitten met onderscheiden absorptie / emissie spectra te uiten. Biologische toepassingen zoals het volgen van herprogrammering factoren naar pluripotentie 33, de analyse van subnucleaire factoren voor de opheldering van nucleolaire lokalisatie 34, de constructie van fluorescerende reporter plasmiden voor transcriptionele studies 35 of de genetische kenmerken van neuronen voor de studie van neuronale netwerkarchitectuur 36 , zijn slechts vier voorbeelden van de vele die verschillende fluorescent proteïne genen benut voor dezelfde experimentele opstelling. Flowcytometrie ruim is toegepast voor de analyse van biologische processen op enkele cel niveau, zoals genexpressie, celcyclus, apoptose en signalering door fosforylatie 37-43 .De stabiele expressie van fluorescent proteïne genen in zoogdiercellen is verder versterkt het nut van flowcytometrie voor celanalyse 38,44 en ligand-receptor interacties 45. Verbeterde mogelijkheden hebben stroom toegestaan ​​cytometrie een veel gebruikt methodologie voor high-throughput en high content 46 geworden. Ondanks het nu uitgebreid aantal fluorometers en robotica technologieën die paar plaatafleesinrichting systemen, beeldvorming en kan flowcytometrie, lijkt er een gebrek in de experimentele ontwerp dat kan benutten en past deze verbeterde technologische mogelijkheden zijn. Snel, betrouwbaar, eenvoudig en robuust cellen gebaseerde methoden zijn drastisch nodig voor multiplex-toepassingen die verder te verbeteren high-throughput capaciteit. Dit geldt vooral op het gebied van geneesmiddelen waarbij techniek celgebaseerde proeven in een gemultiplexte vorm het vermogen van high-throughput screening 39,47-50 kan verbeteren </sup&gt;. Multiplexing, omdat maakt gelijktijdige analyses in een monster, verder verbetert high-throughput mogelijkheden 51-54. Fluorescerende genetische barcoding maakt niet alleen voor elegante multiplexing, maar ook, zij eenmaal, omzeilt de noodzaak van tijdrovende protocollen, verlaagt de kosten gepaard met antilichamen, kralen en vlekken 39,52,55, en kan het aantal schermen die nodig is voor high verminderen throughput toepassingen. We hebben recent beschreven hoe retrovirale technologie multiplexen via fluorescent genetische barcode verbeteren voor biologische toepassingen, door expressie een assay die eerder HIV-1 protease-activiteit 56,57 monitor met verschillende klinisch voorkomende varianten 58. De methodologie wordt toegelicht in een meer beschrijvende manier te focussen op hoe om te selecteren en te versterken genetisch fluorescerende barcode cellen en hoe panelen van klonale populaties uiten verschillende fluorescerende eiwitten en / of verschillende fluorescentie intensit producerenies. Panelen van celpopulaties onderscheiden op basis van hun fluorescerende eigenschappen verbeteren gemultiplexte vermogens, die verder in combinatie kunnen worden benut met celgebaseerde proeven die verschillende biologische vragen pakken. Het protocol beschrijft ook hoe je een panel van barcode cellen die één van de cel-gebaseerde testen die eerder ontwikkeld in het laboratorium ingenieur, zoals bijvoorbeeld 59. Dit protocol is dus niet bedoeld om de gevestigde retrovirale / lentivirale technologie voor genetische overdracht, de waarde van fluorescerende eiwitten of de toepassing van flowcytometrie 60,48 laten maar om het versterkende kracht van het combineren van de drie voor gemultiplexte aanvragen blijkt.

<table><tbody><tr><td>10 ml spuiten</td><td>BD</td><td>309604</td><td>gebruikt voor het filteren van het virus</td></tr><tr><td>0,45 &micro;m ploytetrafluorethyleen filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td>gebruikt voor het filteren van het virus</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>45000-304</td><td>celgroeimedia voor HEK 293T cellen</td></tr><tr><td>PEI (Polyethyleenimien)</td><td>poly sciences</td><td>23966-2</td><td>2 mg/ml concentratie gebruikt</td></tr><tr><td>Hangende emmercentrifuge (gekoeld)</td><td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td><td>gebruikt voor spininfectie</td></tr><tr><td>PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>gebruikt voor het wassen van cellen</td></tr><tr><td>Polybrene (hexadimethreen bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>Gebruikt om de efficiëntie van virale infectie te verhogen. Gebruikt op een 5 &micro;g/ml concentratie.</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>instrument gebruikt voor het sorteren van celpopulaties</td></tr><tr><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>instrument gebruikt voor celanalyse</td></tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>Gift van Gary Nolan</td><td></td><td>cellijn gebruikt om retrovirale deeltjes te produceren</td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Mediatech</td><td>MT35015CV</td><td>gebruikt voor celgroei en sortering</td></tr><tr><td>SupT1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>Menselijke T-lymfoblasten</td></tr><tr><td>HEK 293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Menselijke embryonale niercellen die ook het SV40 grote T-antigeen bevatten</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>celgroeimedia voor SupT1 cellen</td></tr></tbody></table>

genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending toepassingen

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescente eiwitten, fluorescente kleurstoffen en fluoroforen in het algemeen hebben de moleculaire celbiologie gerevolutioneerd. Met name de ontdekking van fluorescente eiwitten en hun genen heeft de engineering van eiwitfusies mogelijk gemaakt voor lokalisatie, de analyse van transcriptionele activering en translatie van eiwitten van belang, of het algemene volgen van individuele cellen en celpopulaties. Het gebruik van genen voor fluorescente eiwitten in combinatie met retrovirale technologie heeft verder de expressie van deze eiwitten in zoogdiercellen op een stabiele en betrouwbare manier mogelijk gemaakt. Hier wordt getoond hoe men deze genen kan gebruiken om cellen binnen een populatie cellen hun eigen biosignature te geven. Aangezien de biosignature wordt bereikt met retrovirale technologie, worden cellen onbepaald lang gebarcodeerd. Als zodanig kunnen ze afzonderlijk worden gevolgd binnen een mengsel van gebarcodeerde cellen en worden gebruikt in meer complexe biologische toepassingen. Het volgen van verschillende populaties in een mengsel van cellen is ideaal voor multiplexed toepassingen zoals de ontdekking van geneesmiddelen tegen een veelvoud van doelen of het activeringsprofiel van verschillende promotoren. Het protocol beschrijft hoe men elegant gebarcodeerde zoogdiercellen kan ontwikkelen en amplificeren met verschillende genetische fluorescente markers, en hoe men meerdere markers tegelijk of één marker op verschillende intensiteiten kan gebruiken. Ten slotte beschrijft het protocol hoe de cellen verder kunnen worden gebruikt in combinatie met cel-gebaseerde assays om de kracht van analyse door multiplexing te verhogen.

Multiplexing fluorescerende genetisch barcode cellen ten behoeve van biologische toepassingen kan alleen worden bereikt wanneer individuele klonale populaties zijn gegenereerd. Multiplexing is het meest effectief wanneer barcode populaties duidelijk te onderscheiden fluorescerende eigenschappen met minimale spectrale overlap. De in figuur 1 met klonale populaties van cellen zoogdiercellen SupT1 voorbeeld illustreert dat barcode cellen met mCherry en cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gemakkelijk simultaan ...

Sinds de ontdekking van het groene fluorescente eiwitgen, hebben fluorescente eiwitten invloed gehad op de moleculaire celbiologie. Dit protocol beschrijft hoe expressie van verschillende fluorescente eiwitten door genetische manipulatie wordt gebruikt voor het barcoden van individuele cellen. De procedure maakt het mogelijk om verschillende populaties in een cellenmengsel te volgen, wat ideaal is voor multiplextoepassingen.

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om zoogdiercellen fluorescent te barcoderen om gemultiplexte biologische assays met een hoge doorvoersnelheid te verbeteren die afhankelijk zijn van verschillende fluorescente read-outs. Hiervoor worden retrovirale deeltjes gebruikt om fluorescerende eiwitten stabiel tot expressie te brengen in zoogdiercellen, waardoor ze worden gebarcodeerd. Vervolgens wordt fluorescentie-geactiveerde cel-sortering uitgevoerd om clonale gebarcodeerde populaties te verkrijgen.De clonale populaties worden vervolgens geamplificeerd, gecombineerd en geanalyseerd via flowcytometrie om te bevestigen dat ze van elkaar te onderscheiden zijn en derhalve gelijktijdig kunnen worden gebruikt. Ten slotte worden de gebarcodede cellijnen getransduceerd met getagde assay-eiwitten en wordt de biologische activiteit gemonitord met behulp van fluorescentiekanalen die verschillen van de gebarcodede kanalen.De resultaten tonen het nut aan van fluorescerende barcode-coating van zoogdiercellen voor gemultiplexte toepassingen in een high-throughput omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, die een zorgvuldige kalibratie van antilichamen of kleurstoffen vereisen, is dat genetisch gebarcoded cellijnen, zodra ze zijn vastgesteld, geen verdere manipulatie behoeven; aangezien het eiwit van belang gedurende lange perioden tot expressie komt, kunnen ze verder worden gebruikt voor biologische adaptaties. De koppeling van fluorescent genetisch gebarcoded cellijnen met oppervlakte-assays stelt ons in staat om biologische functies of effecten onafhankelijk van elkaar te onderzoeken in een high-throughput formaat.In ons voorbeeld gebruiken we een fluorescente genetische barcodering om de splitsing van verschillende virale substraten via multiplexing te monitoren. De assay kan verder worden ingezet om de betrokken mechanismen bij de splitsing te onderzoeken en voor high-throughput drug discovery. Zaai de dag voor de transfectie een plaat van 10 centimeter met 2,5 × 10⁶ Phoenix GP-cellen in DMEM met 10% FBS.Deze verpakkingscellijn tot expressie van gag- en pole-eiwitten voor de vorming van retrovirale particles in trans. Gebruik op de dag van de transfectie een lichtveldmicroscoop om de cellen te inspecteren. De cellen moeten gezond zijn en als een monolaag aan de plaat hechten om geschikt te zijn voor transfectie.Bereid vervolgens het DNA-transfectiemengsel voor in 125 µL serumvrij DMEM. Voeg drie µg van de vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein-vector, P-C-I-V-S-V-G, en drie µg van de transfervector die het fluorescerende eiwitgen van belang draagt toe; voeg 15 µL polyetheramine-transfectiereagens toe en meng dit om viraal particles te verkrijgen die verschillende fluorescerende eiwitmarkers dragen. Voer elke transfectie onafhankelijk uit met de marker naar keuze om dit te bereiken.Incubeer elk mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Transfect na de incubatie door het mengsel druppelgewijs aan de cellen toe te voegen. Incubeer de platen vervolgens bij 37 °C. Vervang optioneel na 24 uur het medium door zeven milliliter vers medium.Hoewel dit de gezondheid van de cellen kan verbeteren, kan het de virale load in het supernatant verminderen. Gebruik 48 uur na transfectie een pipet om het supernatant, dat de viruspartikels bevat, over te brengen naar een spuit van 10 milliliter. Voorzie deze van een 0,20 micromolar polytetrafluoroethyleenfilter en druk de zuiger in om het filtraat in microcentrifugebuisjes van twee milliliter te dispenseren.Zet een aliquot van twee milliliter apart voor onmiddellijk gebruik. Plaats het resterende virale supernatant en de aliquots op ijs en breng deze over naar -80 °C tot ze worden gebruikt. Zaai 24 uur vóór transductie in elke put van een zes-putsplaat 2,0 tot 3,0 × 10⁵ adherente cellen; hier zijn 293T-cellen gebruikt. Verwijder de volgende dag het bestaande medium uit de plaat om de adherente cellen te transduceren.Voeg vijf µg/mL poly brain toe aan de 2 mL van het eerder verzamelde viraal supernatant en voeg het mengsel voorzichtig toe aan de cellen. Verzegel de platen met Parafilm. Plaats de platen vervolgens in een incubatiebak.Centrifugeer bij 1500 ×g gedurende 120 minuten bij 32 °C. Incubeer de cellen na het centrifugeren bij 37 °C en 5% CO2. Vervang na 24 uur het celmedium gedurende ten minste 72 uur.Na de transductie. Bereid de analyse van de getransduceerde cellen voor via flowcytometrie om het transductiepercentage te kwantificeren. Gebruik eerst een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle om er zeker van te zijn dat de gates in de juiste kanalen correct zijn ingesteld.Stel de parameters voor de kanaalspanning zo in dat de negatieve populatie op elke relevante fluorescentie-as onder de waarde van 10³ ligt. Stel vervolgens de gates voor positieve fluorescentie in als gebeurtenissen die buiten die van de negatieve controle vallen. Bepaal daarna, met behulp van de getransduceerde cellen, het percentage positieve cellen voor het specifieke fluorescentiekanaal.Sorteer de cellen in conische buizen van 15 milliliter die één milliliter 100% FBS bevatten. Centrifugeer vervolgens de gesorteerde populaties in een hangende bucket. Gebruik een rotorcentrifuge bij 524 ×g bij 32 °C gedurende vijf minuten.Resuspendeer de cellen na het centrifugeren in één milliliter vers medium en zaai vervolgens 2 × 10⁶ cellen in twee milliliter DMEM op een plaat van zes centimeter. Bij deze concentratie ligt de confluentie onder de 60%, wat groei en deling voor ten minste twee dagen mogelijk maakt. Plaats de cellen gedurende enkele dagen in een incubator bij 37 °C om tijd te geven voor amplificatie.Klonale populaties kunnen worden gegenereerd uit zowel de oorspronkelijk getransduceerde als de gesorteerde cellen. Het sorteren van nauwe populaties op basis van een gekozen fluorescentie, in plaats van individuele klonen in deze fase, waarborgt een reservepopulatie voor toekomstige selectie. Indien nodig, stel de gates voor sortering in volgens de populaties van belang en zorg ervoor dat de gates ten minste één logaritmische schaal uit elkaar liggen. Om onderscheidbare populaties te verkrijgen met een geautomatiseerde celdepositie-unit, moeten individuele cellen in 96-wellplaten worden gesorteerd; houd er rekening mee dat er gemiddeld één cel per well aanwezig zal zijn.Sommige wells bevatten mogelijk geen cellen en andere kunnen meer dan één bevatten. Na het sorteren worden de cellen gedurende ten minste twee weken geïncubeerd bij 37 °C om de individuele klonen te amplificeren. Controleer de cellen regelmatig onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de groeiende populaties voortkomen uit individuele cellen en niet uit meer dan één.Zorg er daarnaast voor dat de cellen niet overgroeien nadat er twee weken zijn verstreken. Screen de vermeende clonale populaties via flowcytometrie en vergelijk deze met een negatieve controlepopulatie. Echte clonale populaties moeten zeer nauwe fluorescentiepatronen vertonen.Kies de populaties die het meest duidelijk gescheiden zijn op basis van de gemiddelde intensiteit en de compactheid van de populatie. Amplificeer deze indien nodig of bewaar stocks in vriesmedium met 10% DMSO bij -80 °C voor korte perioden of in vloeibare stikstof voor langere perioden. Test vervolgens of clonale populaties succesvol kunnen worden gebruikt in een multiplex high-throughput screeningsysteem.Kies een set klonen met onderscheidbare absorptie- en emissiespectra en/of verschillende intensiteiten, en combineer deze in een enkele tube als seed. Verdeel 50.000 van de gecombineerde cellen in 200 µL aangevuld DMEM over elke put van een 96-wells plaat vanuit afzonderlijke tubes. Bereid negatieve controles en enkelkleurige controles voor om de parameters en compensatiewaarden op de flowcytometer in te stellen.Stel de compensatiewaarden in. Analyseer vervolgens het monster om te controleren of elke onafhankelijk vastgestelde fluorescente cellijn kan worden onderscheiden. Om de gebarcodeerde cellijnen aan te passen aan een biologische toepassing, selecteert u eerst assay-elementen die zodanig zijn ontwikkeld dat ze gekoppeld zijn aan een tag of fluorescerend eiwit als een fusie of via een internal ribosome entry site.Ires, waardoor eenvoudige detectie mogelijk is via western blotting, flowcytometrie of microscopie. Het hier gebruikte systeem bestaat uit een biologische assay waarin een HIV-envelop-eiwit op het celoppervlak wordt tot expressie gebracht, waarbij de HA- en flag-tags worden blootgesteld. Het assay-eiwit wordt tot expressie gebracht in een gebarcodeerde cel die TD tomato tot expressie brengt.De splitsing van het eiwit kan worden gemonitord door kleuring met een FSE-gelabeld Anti-Flag-antilichaam. Wanneer het eiwit niet wordt gesplitst, is er kleuring zichtbaar, maar wanneer het eiwit wordt gesplitst, is de groene fluorescentielabeling niet langer evident. Om de biologische assay in de gebarcodeerde cellen op te zetten, transduceert u deze met virale deeltjes die de gekozen assay-elementen bevatten.Voeg viraal SUP natin toe aan de gekozen cellen en centrifugeer deze. Incubeer vervolgens de cellen met fluorescent gelabelde anti-HA-antilichamen. Sorteer daarna de gebarcodeerde cellen om die te isoleren die assay-elementen bevatten die positief zijn voor ha.Combine tot slot de verschillende gecodeerde cellijnen, waarbij elke lijn een assay bevat met een ander substraat. Incubeer het cellenmengsel met Anti-Flag en ZI-geconjugeerde antilichamen en analyseer deze via flowcytometrie om vast te stellen of klieving van het eiwit heeft plaatsgevonden. Volg de assay terug, analyseer of decodeer de populaties in hetdesbetreffende kanaal waarin de verschillende genetisch gecodeerde cellijnen van elkaar onderscheiden kunnen worden.Het PE-kanaal voor TD-tomato wordt vervolgens gebruikt om de aard van het substraat te ontcijferen door analyse in het FITC-kanaal, om zo de positieve populatie te onthullen voor het assayen van de splitsing van oppervlakkig tot expressie gebrachte eiwitten in de secretoire route. Sub T1-cellen zijn fluorescentie-gecodeerd om TD-tomato tot expressie te brengen en zijn gesorteerd in drie populaties met verschillende intensiteiten. Elke populatie werd vervolgens getransduceerd met een ander retrovirus om de expressie van het wild-type HIV-envelop-eiwit, het mutante HIV-envelop-eiwit of het denguevirus te induceren.PRM-boundary-eiwit, elk geflankeerd door flag- en HA-tags. De getransduceerde cellen werden geïncubeerd met anti-HA- en anti-Flag-antilichamen. Anti-HA-kleuring werd uitgevoerd om de aanwezigheid van het gemodificeerde assay-eiwit te bevestigen, terwijl anti-Flag-kleuring werd uitgevoerd om te bepalen of het was gesplitst.Wanneer ongekleurde gecombineerde populaties via flowcytometrie werden geanalyseerd, waren clonale populaties te onderscheiden op basis van de TD-tomaatbarcode, maar niet in het fite-kanaal. In tegenstelling hiermee was, wanneer dezelfde populaties werden gekleurd met flag-fite-antilichamen, één populatie positief voor flagg. Op basis van barcoding kan deze populatie eenvoudig worden geïdentificeerd als de populatie die het mutante HIV-envelope-substraat it draagt.Nu zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u retro-kleptechnologie in combinatie met flowcytometrie kunt gebruiken. Om fluorescerende genetisch gebarcodeerde cellijnen vast te stellen voor vier biologische toepassingen in een multiplex-formaat: de mogelijkheid om fluorescerende genetisch gebarcodeerde cellen te koppelen aan celgebaseerde assays in een multiplex-formaat vergroot de high-throughput mogelijkheden aanzienlijk. Nadat de cellijnen zijn gegenereerd, is het belangrijk om deze in te vriezen.Ontdooi ze vervolgens periodiek, analyseer ze opnieuw en vries ze daarna weer in. Hoewel het genereren van fluorescent genetisch gebarcodeerde cellijnen in eerste instantie tijdrovend kan zijn, verbeteren ze, eenmaal gevestigd, de reproduceerbaarheid en robuustheid van toekomstige toepassingen aanzienlijk.

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.

Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen

Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads door fluorescentie-geactiveerde celsortering op agarplaten, scheidt de sporen door roeren met glaskralen, en bepaalt welke willekeurig bekleed kolonies afgeleid van dezelfde oorspronkelijke viertal behulp van moleculaire barcodes.

BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerpen van een multiplex immunofluorescentie-antilichaampaneel voor op DNA-barcodes gebaseerde beeldvorming van muizen FFPE-melanoomweefsels. We beschrijven ook een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source tools voor het genereren van ruimtelijke proteomics-inzichten in de immuunmicro-omgeving van de muizenmelanoomtumor.

Op DNA-barcode gebaseerde multiplex immunofluorescentiebeeldvorming om FFPE-monsters van genetisch geherprogrammeerd muizenmelanoom te analyseren

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Leer hoe je fluorescerende barcodes in zoogdiercellen introduceert via retrovirale transductie voor multiplexed high-throughput assays. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van meerdere celpopulaties mogelijk.

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Meer video's verkennen