Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

Dit protocol maakt gebruik van een statische suspensiecultuurstrategie voor het differentiëren van voorlopercellen van de alvleesklier in eilandjesclusters, vermindert de spanningen die cellen ervaren tijdens het schudden van de cultuur en verbetert het differentiatiesucces aanzienlijk. Het hardwareprotocol is beginnersvriendelijk en bespaart tijd voor optimalisatie van de eerste vier fasen. Personeel met elementaire stamcelkweektechnieken kan dit protocol reproduceren met een goede kans op het genereren van functionele eilandjesachtige clusters.

Smeer om te beginnen de kweekputjes voor met hESC-gekwalificeerde matrigel verdund in ijskoude DMEM/F12 en plaats de plaat gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius 5% kooldioxide. Zuig het verbruikte medium uit de hPSC-cultuur op en spoel eenmaal met DPBS. Dissocieer hPSC-cultuur in afzonderlijke cellen met celdissociatie-enzym bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten.

Spoel de cellen na dissociatie door warm DMEM/F12-medium toe te voegen en breng ze over in een conische buis van 15 of 50 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 G gedurende vijf minuten en resuspendeer de pellet in een stamcelcompleet medium dat 10-micromolair Y-27632 bevat. Voer vervolgens live celtellingen uit met behulp van een hemocytometer.

Na het tellen aspireren verdunde matrigel en zaai onmiddellijk levende cellen met een dichtheid van 1,6 tot 1,8 keer 10 tot vijf per vierkante centimeter op met matrigel beklede putjes. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator. Bereid vervolgens op de eerste fase, de eerste dag, het medium van fase 1A voor.

Vervang het verbruikte medium door fase 1A-medium en incubeer gedurende 24 uur. Vervang de volgende dag het gebruikte medium uit de putjes door vers bereid fase 1B-medium. Bereid op fase twee, dag één, fase 2A-medium voor en vervang het medium uit putten door stadium 2A-medium.

Incubeer gedurende 24 uur voordat stadium 2B-medium in de putjes wordt toegevoegd; Een fase drie, dag één, zuig het verbruikte medium uit putten op, voeg vervolgens vers bereid fase 3-medium toe en incubeer in een bevochtigde incubator. Vervang op fase vier, dag één, het gebruikte medium door vers bereid stadium 4-medium en incubeer in een bevochtigde incubator. Behandel de microwells op fase vier, dag vijf, voor met 500 microliter antikleefspoeloplossing per putje.

Centrifugeer de microtiterplaat gedurende vijf minuten bij 1.300 G en observeer onder een microscoop om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in microtitertjes vast komen te zitten. Zuig vervolgens de spoeloplossing uit de putjes en spoel eenmaal met één milliliter DPBS. Voeg vervolgens een milliliter aggregatiemedium toe aan elk putje.

Na het verwijderen van het verbruikte medium uit de voorloperculturen van de alvleesklier, wast u de cultuur eenmaal met DPBS voordat u gedurende 10 tot 12 minuten dissocieert in afzonderlijke cellen met dissociatiereagens bij 37 graden Celsius. Spoel de cellen af met warme DMEM/F12 en doe ze in een buis om gedurende vijf minuten bij 300 G te centrifugeren. Resuspendeer de pellet in het aggregatiemedium en voer levende celtellingen uit.

Zaai 2,4 tot 3,6 miljoen cellen per putje en voeg een aggregatiemedium toe aan elk putje om een uiteindelijk volume van twee milliliter per putje te bereiken. Gebruik een P-1000 pipetpunt om de cellen voorzichtig op en neer te pipetten voor een gelijkmatige verdeling. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 300 G om de cellen in de microwells op te vangen en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator om de aggregatie op gang te brengen.

Pipeteer de aggregaten na aggregatie voorzichtig een paar keer op en neer om eventuele niet-geaggregeerde cellen te laten zweven. Zodra de aggregaten zijn neergedaald, verwijdert u voorzichtig het gebruikte medium dat drijvende niet-geaggregeerde cellen bevat zonder aggregaten op te zuigen. Breng vers stadium 5-medium aan op het oppervlak van de microtiterplaat om aggregaten uit de microwells los te maken en breng ze over naar de ultralage bevestigingsplaat met zes putjes.

Nadat u alle aggregaten in de zes putjes met ultralage bevestiging hebt verzameld, resuspendeert u ze in fase 5-medium om de dichtheid aan te passen tot 20 clusters per 100 microliter. Doseer vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet 50 microliter stadium 5-medium in elk putje van een ultralaag ULA-opzetstuk met platte bodem en 96 putjes. Vul de hoek- en randputjes met 200 microliter DPBS.

Meng elke keer voorzichtig clusterresuspensie voordat u het doseert. Voeg vervolgens 100 microliter van de clusterresuspensie toe aan elk putje van de ULA-plaat met platte bodem met 96 putjes. Plaats de kweekplaten gedurende 24 uur op een vlakke ondergrond in een bevochtigde incubator.

Verwijder de volgende dag of in fase vijf, dag twee, met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig 90 microliter van het verbruikte medium uit elk putje en ververs met 100 microliter stadium 5-medium. Vervang op fase zes, dag één, de 90 microliter verbruikt medium door 100 microliter stadium 6 medium per putje. Verwijder op de eerste dag van fase zeven het verbruikte medium en voeg 100 microliter stadium 7-medium per putje toe.

In deze studie, met behulp van microtiterplaten, werden duizenden clusters van voorlopercellen van de alvleesklier met uniforme grootte en morfologie tegelijk gegenereerd, en de gemiddelde aggregatie-efficiëntie was ongeveer 74%Belangrijk is dat de expressie van PDX1 en NKX6.1 na aggregatie op hoge niveaus in deze clusters werd gehandhaafd. Cellen die insuline tot expressie brengen, werden geleidelijk geïnduceerd in endocriene clusters, zoals blijkt uit verhoogde insuline GFP-signalen in levende culturen in de loop van de tijd. De clustergrootte neemt toe van een gemiddelde diameter van 150 micron tot 220 micron tussen fase vijf en zeven.

Karakterisering van de celsamenstelling toont aan dat stadium zeven hPSC-eilandjes die door het hybride protocol werden gegenereerd, voornamelijk endocrien waren en bestonden uit vier belangrijke eilandjesceltypen. Dit hybride protocol genereerde grotendeels monohormonale eilandjescellen en een minderheid van bihormonale cellen. Differentiërende bètacellen brengen NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 en GLUT1 tot expressie.

Bovendien werden 60% insuline en PDX1 dubbelpositieve cellen en 50% C-peptide en NKX6.1 dubbelpositieve cellen geïnduceerd in stadium zeven culturen. In vitro toonden statische glucose-gestimuleerde insulinesecretietests aan dat hPSC-eilandjes in stadium zeven hoge insulinespiegels afscheiden als reactie op hoge glucose en directe depolarisatie. Het totale insulinegehalte van hPSC-eilandjes is ongeveer de helft van het aantal kadavereilandjes.

Het multi-well-based statische kweeksysteem voor het genereren van stamcel-afgeleide eilandjes faciliteert verschillende in situ assays en kan dienen als een geschikt platform voor protocolontwikkeling en kleinschalige screeningsstudies. Om clusterfusie tijdens een statische kweek in een plaat met 96 putjes tot een minimum te beperken, mag u de plaat niet kantelen bij het uitvoeren van de mediumwissel. Houd de plaat altijd horizontaal op een vlakke ondergrond.