Name: Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie met licht-, transmissie-elektronen- en confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Satoshi Kinoshita en de University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) bedanken voor het voorbereiden van onze weefsels op lichtmicroscopie. Deze kern wordt ondersteund door het UW Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) en het Office of The Director-NIH (S10OD023526). Confocale microscopie werd uitgevoerd in de UW Biochemistry Optical Core, die werd opgericht met steun van de UW Department of Biochemistry Endowment. Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van het National Eye Institute (R01EY022086 aan A. Ikeda; R01EY031748 naar C. Bowes Rickman; P30EY016665 naar de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen van het UW; P30EY005722 naar het Duke Eye Center; NIH T32EY027721 naar M. Landowski; F32EY032766 aan M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); en een onbeperkte subsidie van het Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

<ol><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progess+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+to+study+retinal+pigment+epithelium-related+pathogenesis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).</li>
<li>Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+models+and+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Cellular models and therapies for age-related macular degeneration.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).</li>
<li>Landowski, M., Bowes Rickman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lipid+metabolism+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%3A+Insights+from+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).</li>
<li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of age related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).</li>
<li>Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+retinal+diseases+and+their+applicability+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperreflective+foci%2C+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration%2C+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+complement+factor+H+prevents+age-related+macular+degeneration-like+retina+damage+and+kidney+abnormalities+in+aged+Cfh+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice.</a> The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-amyloid+therapy+protects+against+retinal+pigmented+epithelium+damage+and+vision+loss+in+a+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histologic+findings+in+age-related+macular+degeneration+with+RPE+flatmount+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images.</a> Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
<li>Gambril, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+retinal+pigment+epithelium+dysmorphia+and+loss+of+histologic+autofluorescence+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).</li>
<li>Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+atrophy%3A+a+histopathological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Geographic atrophy: a histopathological assessment.</a> JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+retinal+pigment+epithelium+phenotypes+in+the+transition+to+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Retina. 36, 12-25 (2016).</li>
<li>Sura, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+basal+laminar+deposit+and+Bruch%27s+membrane+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+morphology+of+human+macular+and+peripheral+Bruch%27s+membrane+in+older+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes.</a> Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).</li>
<li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy%3A+a+clinicopathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).</li>
<li>Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometrics%2C+impact%2C+and+significance+of+basal+linear+deposit+and+subretinal+drusenoid+deposit+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).</li>
<li>Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial-section+electron+microscopy+using+automated+tape-collecting+ultramicrotome+%28ATUM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM).</a> Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).</li>
<li>Yamaguchi, M., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+of+microorganisms+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>Landowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Tmem135+leads+to+retinal+pigmented+epithelium+pathologies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+age-related+changes+to+the+elastic+lamina+of+Bruch%27s+membrane+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+cell+multinucleation+in+the+aging+eye+-+a+mechanism+to+repair+damage+and+maintain+homoeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis.</a> Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).</li>
<li>Ortín-Martínez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-topographic+maps+for+regionally+enhanced+analysis+of+visual+space+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+Potential+targets+for+protection+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).</li>
<li>Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+fundus+and+retinal+studies+with+SD-OCT%3A+a+comparison+of+five+mouse+inbred+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains.</a> Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).</li>
<li>Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+correlation+of+mouse+photoreceptor-RPE+thickness+between+SD-OCT+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).</li>
<li>Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structural+assessments+of+ocular+disease+in+rodent+models+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li>
</ol>

De auteurs van dit protocol hebben geen openbaarmakingen en belangenconflicten.

In dit artikel hebben we een fenotyperingsprotocol geïntroduceerd voor het beoordelen van de structurele RPE-pathologieën van muismodellen. We beschreven de stappen die nodig zijn voor het verwerken van de ogen voor verschillende beeldvormingstechnieken, waaronder licht, transmissie-elektron en confocale microscopie, evenals de kwantificering van typische pathologieën die via deze beeldvormingsmethoden worden waargenomen. We hebben de effectiviteit van ons RPE-fenotyperingsprotocol bewezen door Tmem135 ...

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een veel voorkomende blinderende ziekte die populaties ouder dan 55 jaar treft1. Veel onderzoekers geloven dat disfunctie binnen het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) een vroege en cruciale pathobiologische gebeurtenis is bij AMD2. De RPE is een monolaag van gepolariseerde cellen belast met het handhaven van de homeostase van naburige fotoreceptoren en choroïdale bloedvaten3. Er bestaan verschillende modellen om ziektegerelateerde mechanismen binnen de RPE te onderzoeken, waaronder celkweekmodellen4,5 en muizen 6,7,8. Een recent rapport heeft gestandaardiseerde protocollen en kwaliteitscontrolecriteria voor RPE-celcultuurmodellen4 beschreven, maar geen enkel rapport heeft geprobeerd de fenotypering van de RPE in muismodellen te standaardiseren. In feite missen veel publicaties over muismodellen van AMD een volledige beschrijving van de RPE of kwantificering van de RPE-pathologieën daarin. Het algemene doel van dit protocol is om standaard RPE-fenotyperingsmethoden te presenteren met onbevooroordeelde kwantitatieve beoordelingen voor wetenschappers die AMD-muismodellen gebruiken.
Eerdere publicaties hebben de aanwezigheid van verschillende RPE-pathologieën bij muizen opgemerkt door middel van drie beeldvormingstechnieken. Met lichtmicroscopie kunnen onderzoekers bijvoorbeeld de grove morfologie van het muizennetvlies bekijken (figuur 1A) en RPE-pathologieën detecteren, zoals RPE-verdunning, vacuolisatie en migratie. RPE-verdunning in een AMD-muismodel wordt geïllustreerd door een afwijking in de RPE-hoogte van hun respectieve bedieningselementen (figuur 1B). RPE-vacuolisatie kan worden onderverdeeld in twee afzonderlijke categorieën: microvacuolisatie (figuur 1C) en macrovacuolisatie (figuur 1D). RPE-microvacuolisatie wordt samengevat door de aanwezigheid van vacuolen in de RPE die de totale hoogte niet beïnvloeden, terwijl macrovacuolisatie wordt aangegeven door de aanwezigheid van vacuolen die uitsteken in de buitenste segmenten van de fotoreceptoren. RPE-migratie onderscheidt zich door het focale aggregaat van pigment boven de RPE-monolaag in een retinale doorsnede (figuur 1E). Opgemerkt moet worden dat migrerende RPE-cellen in AMD-donorogen immunoreactiviteit vertonen voor immuuncelmarkers, zoals cluster van differentiatie 68 (CD68)9, en immuuncellen kunnen vertegenwoordigen die RPE-puin overspoelen of RPE die transdifferentiatie ondergaat 9. Een andere beeldvormingstechniek genaamd transmissie-elektronenmicroscopie kan onderzoekers in staat stellen om de ultrastructuur van de RPE en zijn keldermembraan te visualiseren (figuur 2A). Deze techniek kan de overheersende sub-RPE-afzetting bij muizen identificeren, bekend als de basale laminaire afzetting (BLamD) (figuur 2B)10. Ten slotte kan confocale microscopie de structuur van RPE-cellen onthullen door middel van beeldvorming van RPE-flatmounts (figuur 3A). Deze methode kan RPE-dysmorfie blootleggen, de afwijking van de RPE van de klassieke honingraatvorm (figuur 3B). Het kan ook RPE-multinucleatie detecteren, de aanwezigheid van drie of meer kernen in een RPE-cel (figuur 3C). Voor een samenvatting van de soorten RPE-pathologieën die aanwezig zijn in de huidige AMD-muismodellen, verwijzen we onderzoekers naar deze beoordelingen uit de literatuur 6,7.
Onderzoekers die AMD bestuderen, moeten zich bewust zijn van de voor- en nadelen van het gebruik van muizen om RPE-pathologieën te onderzoeken voorafgaand aan het fenotyperingsprotocol. Muizen zijn voordelig vanwege hun relatief korte levensduur en kosteneffectiviteit, evenals hun genetische en farmacologische manipuleerbaarheid. Muizen vertonen ook RPE-degeneratieve veranderingen, waaronder RPE-migratie, dysmorfie en multinucleatie, die worden waargenomen in AMD-donorogen 11,12,13,14,15,16,17; dit suggereert dat vergelijkbare mechanismen ten grondslag kunnen liggen aan de ontwikkeling van deze RPE-pathologieën bij muizen en mensen. Er zijn echter belangrijke verschillen die de vertaalbaarheid van muisstudies naar menselijke LMD beperken. Ten eerste hebben muizen geen macula, een anatomisch verschillend gebied van het menselijk netvlies dat nodig is voor de gezichtsscherpte die bij voorkeur wordt beïnvloed bij AMD. Ten tweede worden sommige RPE-pathologieën bij muizen, zoals RPE-verdunning en vacuolisatie, meestal niet gezien in AMD-donorogen18. Ten derde ontwikkelen muizen geen drusen, een kenmerk van AMD-pathologie19. Drusen zijn lipide- en eiwithoudende afzettingen met zeer weinig keldermembraaneiwitten die zich vormen tussen de RPE basale lamina en de binnenste collageenlaag van het membraan van Bruch (BrM)19. Drusen verschillen van BLamD, de veel voorkomende sub-RPE-afzetting bij muizen, zowel in hun samenstelling als in anatomische locatie. BLamD's zijn leeftijds- en stressafhankelijke extracellulaire matrixverrijkte afwijkingen die zich vormen tussen de RPE basale lamina van BrM en de basale infoldings van de RPE20. Interessant is dat BLamD's een vergelijkbare eiwitsamenstelling en uiterlijk hebben bij zowel muizen als mensen 6,10,21. Recent werk suggereert dat BLamDs kan werken in de pathobiologie van AMD door de progressie van AMD naar zijn latere stadia te beïnvloeden18,22; deze afzettingen kunnen dus zieke RPE in het netvlies van de muis vertegenwoordigen. Kennis van deze voordelen en beperkingen is van cruciaal belang voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vertalen van resultaten van muisstudies naar AMD.
In dit protocol bespreken we de methoden om ogen voor te bereiden op licht, transmissie-elektron en confocale microscopie om RPE-pathologieën te visualiseren. We beschrijven ook hoe we RPE-pathologieën op een onbevooroordeelde manier kunnen kwantificeren voor statistische tests. Als proof of concept gebruiken we het RPE-fenotyperingsprotocol om de structurele RPE-pathologieën te onderzoeken die worden waargenomen in transmembraaneiwit 135- (Tmem135) overexpressiemuizen en verouderde wild-type (WT) C57BL / 6J-muizen. Samenvattend willen we de fenotyperingsmethodologie beschrijven om de RPE in AMD-muismodellen te karakteriseren, omdat er momenteel geen standaardprotocollen beschikbaar zijn. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken en kwantificeren van pathologieën van de fotoreceptoren of het vaatvlies, die ook worden beïnvloed in AMD-muismodellen, vinden dit protocol mogelijk niet nuttig voor hun studies.

```html
<table><tbody><tr><td>0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2</td><td>PolyScientiifc R&amp;D Company</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 Capacity Slide Box</td><td></td><td></td><td>Twee zijn nodig voor dit protocol (een voor H&amp;E-gekleurde dia's en een voor RPE vlakke montages.)</td></tr><tr><td>100% Ethanol&nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>Kan worden gebruikt om verdunde ethanoloplossingen in dit protocol te maken.</td></tr><tr><td>1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td></td><td></td><td>Klaar gemaakte 1x PBS kan worden gebruikt in dit protocol.&nbsp;</td></tr><tr><td>2.0 mL microtubes</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>24 inch PVC Tubing with Luer Ends</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>MDS Warehouse</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable 237 ml&nbsp; Spray Bottle</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Z192546</td><td></td></tr><tr><td>Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5211</td><td>Bekend als gebogen pincetten in dit protocol.</td></tr><tr><td>Camel Hair Brush</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide Euthanasia Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide Flow Meter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide Tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castaloy Prong Extension Clamps</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>Cast-Iron L-shaped Base Support Stand</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>Cell Prolifer Program</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar om te downloaden: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost Microscope Slides Lavender</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H20</td><td></td><td></td><td>Water uit Milli-Q zuiveringssysteem werd gebruikt in dit protocol.</td></tr><tr><td>Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4984</td><td>Bekend als fijne tip forceps in dit protocol, en 3 zijn nodig voor dit protocol (twee voor dissecties en een voor elektronenmicroscoop verwerking).</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Grid Holder</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 Resin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22050460</td><td>Volg het protocol van de fabrikant bij het gebruik van deze weefselmarkeringsverf.&nbsp;</td></tr><tr><td>Epredia Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>Gebruik voor het plaatsen van H&amp;E-dia's.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td><td>Lichtbron voor dissectiemicroscoop.</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Program</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar om te downloaden: https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Flexaframe Castaloy Hook Connector</td><td>Thermo Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Benchtop Shaker</td><td></td><td></td><td>Twee zijn nodig voor deze experimenten. Een moet op kamertemperatuur zijn terwijl de andere in een koude ruimte van 4 graden Celsius moet staan.</td></tr><tr><td>Laser Cryo Tag Labels</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7Ultramicrotome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichert Ultracut S Microtome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22I24788001LS</td><td>Gebruik deze dekglasjes voor de RPE vlakke montages omdat ze verhoogde randen hebben en de dikte van de RPE aanpassen.</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5600</td><td>Bekend als micro-dissectie schaar in protocol.&nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td>Elk AMD-muismodel en de respectieve controles kunnen voor dit protocol werken.</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5913</td><td>Bekend als gebogen schaar in dit protocol.</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtube racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1RS Confocal Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Pencil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>Propylene Oxide</td><td>Electron Microscopy Sciences

een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een slopende retinale aandoening bij vergrijzende populaties. Er wordt algemeen aangenomen dat disfunctie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) een belangrijke pathobiologische gebeurtenis is bij AMD. Om de mechanismen te begrijpen die leiden tot RPE-disfunctie, kunnen muismodellen door onderzoekers worden gebruikt. Uit eerdere studies is gebleken dat muizen RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen, waarvan sommige worden waargenomen in de ogen van personen met de diagnose AMD. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen te beoordelen. Dit protocol omvat de voorbereiding en evaluatie van retinale doorsneden met behulp van lichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie, evenals die van RPE flat mounts door confocale microscopie. We beschrijven de veel voorkomende soorten muizen RPE-pathologieën die door deze technieken worden waargenomen en manieren om ze te kwantificeren door middel van onbevooroordeelde methoden voor statistische tests. Als proof of concept gebruiken we dit RPE-fenotyperingsprotocol om de RPE-pathologieën te kwantificeren die zijn waargenomen bij muizen die transmembraaneiwit 135 (Tmem135) overexpressie overexpressie en verouderde wildtype C57BL / 6J-muizen. Het belangrijkste doel van dit protocol is om standaard RPE-fenotyperingsmethoden te presenteren met onbevooroordeelde kwantitatieve beoordelingen voor wetenschappers die muismodellen van AMD gebruiken.

Voltooiing van het RPE-fenotyperingsprotocol dat in dit artikel wordt beschreven, biedt een kwantitatieve analyse van de structurele RPE-afwijkingen die vaak worden waargenomen in muismodellen van AMD. Om de effectiviteit van dit protocol te bevestigen, gebruikten we het bij muizen waarvan bekend is dat ze RPE-pathologieën vertonen, waaronder transgene muizen die WT Tmem135 overexpressie geven, aangedreven door de kip beta-actine promotor (Tmem135 TG)30 en oude C57BL/6J muizen31,32</...

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Dit protocol is het eerste dat beschrijft hoe de muisgrootte voor RP-pathologieën kan worden verwerkt en geëvalueerd met behulp van lichttransmissie-elektronen- en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de opname van kwantitatieve beoordelingen van de RP-pathologieën, met behulp van deze drie beeldvormingstechnieken voor statistische vergelijkingen. De technieken die in dit protocol worden beschreven, kunnen ook helpen om onze kennis van moleculaire routes die belangrijk zijn voor de gezondheid van RPE uit te breiden.Personen die de muisgrootte nog niet eerder hebben ontleed, kunnen moeite hebben met dit protocol. We raden deze personen aan om met sommige muizen te oefenen om de technieken die in dit protocol worden beschreven onder de knie te krijgen. Bereid om te beginnen een zwaartekrachttoevoerperfusiesysteem voor op een absorberende onderlaag voor hartperfusie in een zuurkast.Giet 40 milliliter vers bereide fixatieve buffer in het spuitvat van het perfusiesysteem. Draai de klep evenwijdig aan de buisleiding om de buffer door de buisleiding te laten stromen. Spoel de lijn door totdat alle luchtbellen uit de lijn zijn verwijderd.Draai vervolgens de klep loodrecht op de buisleiding om te voorkomen dat de buffer in de buisleiding stroomt. Om hartperfusie uit te voeren, brengt u de geëuthanaseerde muis over naar een ondiepe lade in de buurt van het perfusiesysteem. Met de buik naar boven gericht.Spuit de buik met 70% ethanol en maak vervolgens een vijf centimeter inferieure snede met een gebogen schaar en een tang door de huid en buikwand aan de linkerkant van de muis onder de ribbenkast. Ga verder met het maken van een mediale snede van drie centimeter door de huid en buikwand aan de bovenkant van de inferieure snede. Maak nog eens vijf centimeter inferieure snede aan het einde van de mediale snede door de huid en buikwand aan de verste rechterkant van de muis onder de ribbenkast.Maak nog een mediale incisie van drie centimeter om de buikhuidflap met een gebogen tang te verwijderen. Snijd vervolgens door het middenrif en borstbeen om het hart bloot te leggen. Steek de meternaald in de linkerkamer van het hart en draai de klep.Knip het rechter atrium af met een gebogen schaar om bloed en fixatief het hart te laten verlaten. Laat 10 milliliter fixatieve buffer de muis gedurende één tot twee minuten doordrenken, of totdat de lever bleek van kleur wordt en er geen bloed uit het rechter atrium stroomt. Zodra de perfusie is voltooid, draait u de klep loodrecht op de buisleiding om de bufferstroom te stoppen.Om de ogen te nucleeren, verwijdert u de muis uit de ondiepe lade en plaatst u deze op de absorberende onderlegger in een zuurkast. Oriënteer vervolgens de kop van de muis met het linkeroog naar de experimentator gericht en het rechteroog uit het zicht. Annoteer de superieure kant van het oog met een weefselmarkeringskleurstof.Duw voorzichtig rond de oogkas met de duim en wijsvinger naar beneden voor het uitsteeksel van het oog uit de oogkas. Houd vervolgens met een gebogen schaar het oog met het mes in een hoek van 30 graden van de oogkas en knip rond het oog. Verwijder de oogbol van het hoofd met een gebogen tang en plaats deze op een absorberende onderlegger.Snijd het hoornvlies met een scalpelblad nummer 11 en plaats het oog met een gebogen tang in een microbuis van twee milliliter met daarin twee milliliter fixatieve buffer. Nadat je beide ogen hebt genucleeerd, incubeer je ze in een fixerende buffer 's nachts op een shaker in een kamer van vier graden met een snelheid van 75 tpm. Vervang de volgende dag de fixatiebuffer door twee milliliter PBS en incubeer gedurende 10 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en 75 tpm.Plaats naast het genereren van achterste segmenten het oog in een petrischaal gevuld met PBS onder een ontleedmicroscoop. Til vet en spieren voorzichtig weg van de oogbol met een fijne tang. Knip het vet en de spier voorzichtig bij met een micro-ontleedschaar in een parallelle richting aan de oogbol totdat de oogbol een uniforme blauwzwarte kleur heeft Plaats een fijne tang op de hoornvliespunctieplaats en knip rond de omtrek van het hoornvlies beginnend bij de punctieplaats met een micro-ontleedschaar om het hoornvlies en de iris uit de oogbol te verwijderen.Verwijder vervolgens met een tang met fijne punt voorzichtig de lens van de oogbol om het achterste segment te verkrijgen. Plaats het achterste segment in een buis met twee milliliter PBS en bewaar bij vier graden Celsius in een koelkast tot gebruik. Breng het oog over naar een petrischaaltje met PBS en verwijder het hoornvlies en de iris zoals aangetoond.Trek de lens uit met een tang met fijne punt. Scheid vervolgens met behulp van twee fijne tangen het neurale netvlies voorzichtig van het achterste segment. Snijd voorzichtig het neurale netvlies bij de oogzenuwkop voor verwijdering uit de achterste oogcup.Plaats de oogbeker in een microbuisje van twee milliliter met vijf microliter PBS. Om achterste oogschelpen te fixeren, voegt u 500 microliter methanol toe aan het weefsel en incubeert u gedurende vijf minuten op een shaker bij 75 tpm. Herhaal de methanolfixatie drie keer met de laatste incubatie gedurende twee uur.Na fixatie, was het weefsel driemaal met PBS, voordat u overgaat tot immunofluorescentiekleuring en visualisatie door middel van confocale microscopie. Vier maanden oude TMEM 135 TG-muizen vertoonden een significante vermindering van retinale gepigmenteerde epitheel- of RPE-dikte op 600 en 900 micrometer afstand van de oogzenuw, ten opzichte van leeftijdsgematchte wildtype muizen. Incidenten van RPE-pathologieën, waaronder microvascuolisatie, macrovacuolisatie en migratie van 325 dagen oude WT- en TMEM 135 TG-muizen werden berekend.De gemiddelde frequentie van RPE-microvacuolisatie was lager in het wildtype in vergelijking met de TMEM 135 TG-muizen. Er werden geen RPE-macrovacuolisatie en migratie gedetecteerd in wildtype in vergelijking met de gemiddelde waarden waargenomen in TMEM 135 TG-muizen. Bij transmissie-elektronenmicroscopie werden basale laminaire afzettingen waargenomen in 24 maanden oude netvliezen die afwezig waren in twee maanden oude netvliezen.Analyse van cumulatieve frequenties van de basale laminaire afzettingshoogten, wees op een verschuiving naar rechts van de lijn voor de 24 maanden oude, vergeleken met de twee maanden oude, wat een toename van afzettingen bij 24 maanden oude muizen aantoont. Deze waarneming werd ondersteund door grotere gemiddelde lengtes in 24 maanden oude netvliezen. RPE bij vier maanden oude TMEM 135 TG-muizen was dysmorf.De RPE in TMEM 135 TG netvliezen zijn groter en minder dicht dan leeftijdsgebonden wilde netvliezen. Ook werden meer meerkernige RPE-cellen in de TG-netvliezen waargenomen, vergeleken met controles. Volgens dit protocol konden onderzoekers specifieke routes evalueren met behulp van moleculaire biologietechnieken bij muizen, wat zou kunnen bijdragen aan ons begrip van hoe deze RP-pathologieën zich ontwikkelen bij muizen.Dit protocol zal helpen om RP-fenotypering bij muizen te standaardiseren, wat bevindingen uit muisstudies zal vertalen naar andere AMD-modellen en zal helpen bij ons begrip van AMD-pathobiologie.

a-protocol-to-evaluate-quantify-retinal-pigmented-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Indocyaninegroen angiografie (of ICGA) uitgevoerd door staartaderinjectie biedt een hoge kwaliteit ICGA tijdsverloop afbeeldingen om afwijkingen karakteriseren muis choroidea.

Detecteren van afwijkingen in Choroïdale vaatstelsel in een muismodel van Leeftijdsgebonden Macula Degeneratie door Time-cursus indocyaninegroen angiografie

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

We beschrijven een methode om retinaal pigmentepitheel (RPE) efficiënt te scheiden van het netvlies in menselijke ogen en hele RPE / choroïde flatmounts te genereren voor histologische en morfometrische analyses van de RPE.

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Tandem-splijsgebeurtenissen vinden plaats op plaatsen die minder dan 12 nucleotiden uit elkaar liggen. Het kwantificeren van verhoudingen van dergelijke splitsvarianten is haalbaar met behulp van een absolute kwantitatieve PCR-benadering. Dit manuscript beschrijft hoe splitsvarianten van het gen STAT3, waarbij twee splitsgebeurtenissen resulteren in Serine-701 inclusie/uitsluiting en α/β C-termini, kunnen worden gekwantificeerd.

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Leer een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie met licht-, transmissie-elektronen- en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (Video) | JoVE Journal

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Meer video's verkennen