Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Dit protocol is het eerste dat beschrijft hoe de muisgrootte voor RP-pathologieën kan worden verwerkt en geëvalueerd met behulp van lichttransmissie-elektronen- en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de opname van kwantitatieve beoordelingen van de RP-pathologieën, met behulp van deze drie beeldvormingstechnieken voor statistische vergelijkingen. De technieken die in dit protocol worden beschreven, kunnen ook helpen om onze kennis van moleculaire routes die belangrijk zijn voor de gezondheid van RPE uit te breiden.

Personen die de muisgrootte nog niet eerder hebben ontleed, kunnen moeite hebben met dit protocol. We raden deze personen aan om met sommige muizen te oefenen om de technieken die in dit protocol worden beschreven onder de knie te krijgen. Bereid om te beginnen een zwaartekrachttoevoerperfusiesysteem voor op een absorberende onderlaag voor hartperfusie in een zuurkast.

Giet 40 milliliter vers bereide fixatieve buffer in het spuitvat van het perfusiesysteem. Draai de klep evenwijdig aan de buisleiding om de buffer door de buisleiding te laten stromen. Spoel de lijn door totdat alle luchtbellen uit de lijn zijn verwijderd.

Draai vervolgens de klep loodrecht op de buisleiding om te voorkomen dat de buffer in de buisleiding stroomt. Om hartperfusie uit te voeren, brengt u de geëuthanaseerde muis over naar een ondiepe lade in de buurt van het perfusiesysteem. Met de buik naar boven gericht.

Spuit de buik met 70% ethanol en maak vervolgens een vijf centimeter inferieure snede met een gebogen schaar en een tang door de huid en buikwand aan de linkerkant van de muis onder de ribbenkast. Ga verder met het maken van een mediale snede van drie centimeter door de huid en buikwand aan de bovenkant van de inferieure snede. Maak nog eens vijf centimeter inferieure snede aan het einde van de mediale snede door de huid en buikwand aan de verste rechterkant van de muis onder de ribbenkast.

Maak nog een mediale incisie van drie centimeter om de buikhuidflap met een gebogen tang te verwijderen. Snijd vervolgens door het middenrif en borstbeen om het hart bloot te leggen. Steek de meternaald in de linkerkamer van het hart en draai de klep.

Knip het rechter atrium af met een gebogen schaar om bloed en fixatief het hart te laten verlaten. Laat 10 milliliter fixatieve buffer de muis gedurende één tot twee minuten doordrenken, of totdat de lever bleek van kleur wordt en er geen bloed uit het rechter atrium stroomt. Zodra de perfusie is voltooid, draait u de klep loodrecht op de buisleiding om de bufferstroom te stoppen.

Om de ogen te nucleeren, verwijdert u de muis uit de ondiepe lade en plaatst u deze op de absorberende onderlegger in een zuurkast. Oriënteer vervolgens de kop van de muis met het linkeroog naar de experimentator gericht en het rechteroog uit het zicht. Annoteer de superieure kant van het oog met een weefselmarkeringskleurstof.

Duw voorzichtig rond de oogkas met de duim en wijsvinger naar beneden voor het uitsteeksel van het oog uit de oogkas. Houd vervolgens met een gebogen schaar het oog met het mes in een hoek van 30 graden van de oogkas en knip rond het oog. Verwijder de oogbol van het hoofd met een gebogen tang en plaats deze op een absorberende onderlegger.

Snijd het hoornvlies met een scalpelblad nummer 11 en plaats het oog met een gebogen tang in een microbuis van twee milliliter met daarin twee milliliter fixatieve buffer. Nadat je beide ogen hebt genucleeerd, incubeer je ze in een fixerende buffer 's nachts op een shaker in een kamer van vier graden met een snelheid van 75 tpm. Vervang de volgende dag de fixatiebuffer door twee milliliter PBS en incubeer gedurende 10 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en 75 tpm.

Plaats naast het genereren van achterste segmenten het oog in een petrischaal gevuld met PBS onder een ontleedmicroscoop. Til vet en spieren voorzichtig weg van de oogbol met een fijne tang. Knip het vet en de spier voorzichtig bij met een micro-ontleedschaar in een parallelle richting aan de oogbol totdat de oogbol een uniforme blauwzwarte kleur heeft Plaats een fijne tang op de hoornvliespunctieplaats en knip rond de omtrek van het hoornvlies beginnend bij de punctieplaats met een micro-ontleedschaar om het hoornvlies en de iris uit de oogbol te verwijderen.

Verwijder vervolgens met een tang met fijne punt voorzichtig de lens van de oogbol om het achterste segment te verkrijgen. Plaats het achterste segment in een buis met twee milliliter PBS en bewaar bij vier graden Celsius in een koelkast tot gebruik. Breng het oog over naar een petrischaaltje met PBS en verwijder het hoornvlies en de iris zoals aangetoond.

Trek de lens uit met een tang met fijne punt. Scheid vervolgens met behulp van twee fijne tangen het neurale netvlies voorzichtig van het achterste segment. Snijd voorzichtig het neurale netvlies bij de oogzenuwkop voor verwijdering uit de achterste oogcup.

Plaats de oogbeker in een microbuisje van twee milliliter met vijf microliter PBS. Om achterste oogschelpen te fixeren, voegt u 500 microliter methanol toe aan het weefsel en incubeert u gedurende vijf minuten op een shaker bij 75 tpm. Herhaal de methanolfixatie drie keer met de laatste incubatie gedurende twee uur.

Na fixatie, was het weefsel driemaal met PBS, voordat u overgaat tot immunofluorescentiekleuring en visualisatie door middel van confocale microscopie. Vier maanden oude TMEM 135 TG-muizen vertoonden een significante vermindering van retinale gepigmenteerde epitheel- of RPE-dikte op 600 en 900 micrometer afstand van de oogzenuw, ten opzichte van leeftijdsgematchte wildtype muizen. Incidenten van RPE-pathologieën, waaronder microvascuolisatie, macrovacuolisatie en migratie van 325 dagen oude WT- en TMEM 135 TG-muizen werden berekend.

De gemiddelde frequentie van RPE-microvacuolisatie was lager in het wildtype in vergelijking met de TMEM 135 TG-muizen. Er werden geen RPE-macrovacuolisatie en migratie gedetecteerd in wildtype in vergelijking met de gemiddelde waarden waargenomen in TMEM 135 TG-muizen. Bij transmissie-elektronenmicroscopie werden basale laminaire afzettingen waargenomen in 24 maanden oude netvliezen die afwezig waren in twee maanden oude netvliezen.

Analyse van cumulatieve frequenties van de basale laminaire afzettingshoogten, wees op een verschuiving naar rechts van de lijn voor de 24 maanden oude, vergeleken met de twee maanden oude, wat een toename van afzettingen bij 24 maanden oude muizen aantoont. Deze waarneming werd ondersteund door grotere gemiddelde lengtes in 24 maanden oude netvliezen. RPE bij vier maanden oude TMEM 135 TG-muizen was dysmorf.

De RPE in TMEM 135 TG netvliezen zijn groter en minder dicht dan leeftijdsgebonden wilde netvliezen. Ook werden meer meerkernige RPE-cellen in de TG-netvliezen waargenomen, vergeleken met controles. Volgens dit protocol konden onderzoekers specifieke routes evalueren met behulp van moleculaire biologietechnieken bij muizen, wat zou kunnen bijdragen aan ons begrip van hoe deze RP-pathologieën zich ontwikkelen bij muizen.

Dit protocol zal helpen om RP-fenotypering bij muizen te standaardiseren, wat bevindingen uit muisstudies zal vertalen naar andere AMD-modellen en zal helpen bij ons begrip van AMD-pathobiologie.