Name: Een workflow voor lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Ontdek een workflow voor LNP-formuleringoptimalisatie met ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen. Deze methode minimaliseert statistische fouten en produceert informatieve graphics voor betere interpretatie van resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de redacteur en de anonieme referenten dankbaar voor suggesties die het artikel hebben verbeterd.

<ol><li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+lipids+to+power+next+generation+of+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Better lipids to power next generation of mRNA vaccines.</a> Science. 376 (6594), 680-681 (2022).</li>
<li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+mRNA+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The landscape of mRNA nanomedicine.</a> Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).</li>
<li>Rampado, R., Peer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+experiments+in+the+optimization+of+nanoparticle-based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticle+formulations+for+mRNA+delivery+in+vivo+with+fractional+factorial+and+definitive+screening+designs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs.</a> Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).</li>
<li>Jones, B., Nachtsheim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+three-level+designs+for+definitive+screening+in+the+presence+of+second-order+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Quality+Technology%22%5BJournal%5D)">A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects.</a> Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).</li>
<li>Cornell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornell%2C+J+%22Experiments+with+Mixtures%3A+Designs%2C+Models%2C+and+the+Analysis+of+Mixture+Data.+Wiley+Series+in+Probability+and+Statistics%22">Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics</a>. , Wiley. (2002).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+and+improper+use+of+definitive+screening+designs+%28DSDs%29%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+user+Community%22%5BJournal%5D)">Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs).</a> JMP user Community. , https://community.jmp.com/t5/JMP-Blog/Proper-and-improper-use-of-Definitive-Screening-Designs-DSDs/bc-p/546773 (2016).</li>
<li>Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+R+%22Response+Surface+Methodology%22">Response Surface Methodology</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Lekivetz, R., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+flexible+space-filling+designs+for+nonrectangular+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Quality+and+Reliability+Engineering+International%22%5BJournal%5D)">Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions.</a> Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-factor-at-a-time+versus+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Statistician%22%5BJournal%5D)">One-factor-at-a-time versus designed experiments.</a> The American Statistician. 53, 126-131 (1999).</li>
<li>Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JMP+Pro+17+remedies+for+practical+struggles+with+mixture+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments.</a> JMP Discovery Conference. , (2022).</li>
<li>Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439(2021).</li>
<li>Gotwalt, C., Ramsey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+validation+strategies+for+designed+experiments+using+bootstrapping+techniques+with+applications+to+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals.</a> JMP Discovery Conference. , (2018).</li>
<li>Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+fractional-random-weight+bootstrap%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Statistician%22%5BJournal%5D)">Applications of the fractional-random-weight bootstrap.</a> The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).</li>
<li>Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SVEM%3A+A+paradigm+shift+in+design+and+analysis+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference+Europe%22%5BJournal%5D)">SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments.</a> JMP Discovery Conference Europe. , (2021).</li>
<li>Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+innovation+with+space+filling+mixture+designs%2C+neural+networks+and+SVEM%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM.</a> JMP Discovery Conference. , (2021).</li>
<li>Lemkus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Validated+Ensemble+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Doctoral+Dissertations.+2707%22%5BJournal%5D)">Self-Validated Ensemble modelling.</a> Doctoral Dissertations. 2707. , https://scholars.unh.edu/dissertation/2707 (2022).</li>
<li>Juran, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuran%2C+JM+%22Juran+on+Quality+by+Design%3A+The+New+Steps+for+Planning+Quality+into+Goods+and+Services%22">Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services</a>. , Free Press. (1992).</li>
<li>Yu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+pharmaceutical+quality+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding pharmaceutical quality by design.</a> The AAPS Journal. 16, 771(2014).</li>
<li>Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+planning+and+evidence+for+assessing+a+well-designed+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Quality+Engineering%22%5BJournal%5D)">Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment.</a> Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).</li>
<li>Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+by+design+for+enabling+RNA+platform+production+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quality by design for enabling RNA platform production processes.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).</li>
<li>Scheffé, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B%22%5BJournal%5D)">Experiments with mixtures.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).</li>
<li>Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+blending+models+for+data+from+mixture+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Technometrics%22%5BJournal%5D)">General blending models for data from mixture experiments.</a> Technometrics. 57, 449-456 (2015).</li>
<li>Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+endosomal+escape+of+polymorphic+lipid+nanoparticles+that+boost+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery.</a> Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).</li>
<li>Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-validated+ensemble+models+for+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ArXiv%22%5BJournal%5D)">Self-validated ensemble models for design of experiments.</a> ArXiv. , 2103.09303(2021).</li>
<li>Goos, P., Jones, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoos%2C+P+%22Optimal+Design+of+Experiments%3A+A+Case+Study+Approach%22">Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2011).</li>
<li>Rushing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOE+Gumbo%3A+How+hybrid+and+augmenting+designs+can+lead+to+more+effective+design+choices%5BTitle%5D)+AND+%22JMP+Discovery+Conference%22%5BJournal%5D)">DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices.</a> JMP Discovery Conference. , (2020).</li>
</ol>

De experimentele ontwerpstrategie die aan deze workflow ten grondslag ligt, is gebruikt in twee octrooiaanvragen waarbij een van de auteurs een uitvinder is. Daarnaast is Adsurgo, LLC een gecertificeerde JMP-partner. De ontwikkeling en publicatie van dit artikel werden echter ondernomen zonder enige vorm van financiële stimulans, aanmoediging of andere prikkels van JMP.

Moderne software voor het ontwerp en de analyse van mengselprocesexperimenten maakt het voor wetenschappers mogelijk om hun lipide nanodeeltjesformuleringen te verbeteren in een gestructureerde workflow die inefficiënte OFAT-experimenten vermijdt. De recent ontwikkelde SREM-modelleringsbenadering elimineert veel van de geheimzinnige regressiemodificaties en modelreductiestrategieën die wetenschappers eerder mogelijk hebben afgeleid met externe statistische overwegingen. Zodra de resultaten zijn verzameld, biedt het SVEM-...

Lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringen voor in vivo genafgiftesystemen omvatten over het algemeen vier samenstellende lipiden uit de categorieën ioniseerbare, helper- en PEG-lipiden 1,2,3. Of deze lipiden nu alleen of gelijktijdig met andere niet-mengselfactoren worden bestudeerd, experimenten voor deze formuleringen vereisen "mengsel" -ontwerpen omdat - gegeven een kandidaat-formulering - het verhogen of verlagen van de verhouding van een van de lipiden noodzakelijkerwijs leidt tot een overeenkomstige afname of toename van de som van de verhoudingen van de andere drie lipiden.
Ter illustratie wordt verondersteld dat we een LNP-formulering optimaliseren die momenteel een vast recept gebruikt dat als benchmark zal worden behandeld. Het doel is om de potentie van de LNP te maximaliseren en tegelijkertijd de gemiddelde deeltjesgrootte te minimaliseren. De studiefactoren die in het experiment worden gevarieerd, zijn de molaire verhoudingen van de vier samenstellende lipiden (ioniseerbaar, cholesterol, DOPE, PEG), de N: P-verhouding, de stroomsnelheid en het ioniseerbare lipidetype. De ioniseerbare en helperlipiden (inclusief cholesterol) mogen variëren over een breder bereik van molaire verhouding, 10-60%, dan PEG, die in deze illustratie zal variëren van 1-5%. Het referentieformuleringsrecept en de bereiken van de andere factoren en hun afrondingsgranulariteit worden gespecificeerd in aanvullend dossier 1. Voor dit voorbeeld zijn de wetenschappers in staat om 23 runs (unieke batches deeltjes) op één dag uit te voeren en willen dat als hun steekproefgrootte gebruiken als deze aan de minimumvereisten voldoet. Gesimuleerde resultaten voor dit experiment zijn opgenomen in Aanvullend Dossier 2 en Aanvullend Dossier 3. 
Rampado en Peer4 hebben een recent overzichtsartikel gepubliceerd over het onderwerp van ontworpen experimenten voor de optimalisatie van op nanodeeltjes gebaseerde medicijnafgiftesystemen. Kauffman et al.5 beschouwden LNP-optimalisatiestudies met behulp van fractionele factoriële en definitieve screeningsontwerpen6; Dit soort ontwerpen kan echter geen mengselbeperking opvangen zonder toevlucht te nemen tot het gebruik van inefficiënte "spelingsvariabelen"7 en worden meestal niet gebruikt wanneer mengselfactoren aanwezig zijn 7,8. In plaats daarvan worden "optimale ontwerpen" die in staat zijn om een mengselbeperking op te nemen, traditioneel gebruikt voor experimenten met mengselprocessen9. Deze ontwerpen richten zich op een door de gebruiker gespecificeerde functie van de studiefactoren en zijn alleen optimaal (in een van een aantal mogelijke betekenissen) als deze functie de ware relatie tussen de studiefactoren en responsen vastlegt. Merk op dat er in de tekst een onderscheid is tussen "optimale ontwerpen" en "optimale formuleringskandidaten", waarbij de laatste verwijst naar de beste formuleringen die door een statistisch model worden geïdentificeerd. Optimale ontwerpen hebben drie belangrijke nadelen voor experimenten met mengselprocessen. Ten eerste, als de wetenschapper niet anticipeert op een interactie van de studiefactoren bij het specificeren van het doelmodel, dan zal het resulterende model bevooroordeeld zijn en inferieure kandidaatformuleringen kunnen produceren. Ten tweede plaatsen optimale ontwerpen de meeste runs op de buitengrens van de factorruimte. In LNP-studies kan dit leiden tot een groot aantal verloren runs als de deeltjes zich niet correct vormen aan uitersten van de lipide- of procesinstellingen. Ten derde geven wetenschappers vaak de voorkeur aan experimentele runs op het binnenste van de factorruimte om een modelonafhankelijk gevoel van het responsoppervlak te krijgen en het proces direct te observeren in voorheen onontgonnen gebieden van de factorruimte.
Een alternatief ontwerpprincipe is om te streven naar een geschatte uniforme dekking van de (mengselbeperkte) factorruimte met een ruimtevullend ontwerp10. Deze ontwerpen offeren enige experimentele efficiëntie op ten opzichte van optimale ontwerpen9 (ervan uitgaande dat de hele factorruimte leidt tot geldige formuleringen), maar bieden verschillende voordelen in een afweging die nuttig zijn in deze toepassing. Het ruimtevullende ontwerp maakt geen a priori aannames over de structuur van het responsoppervlak; Dit geeft het de flexibiliteit om onverwachte relaties tussen de studiefactoren vast te leggen. Dit stroomlijnt ook de ontwerpgeneratie omdat het niet nodig is om beslissingen te nemen over welke regressietermen moeten worden toegevoegd of verwijderd als de gewenste rungrootte wordt aangepast. Wanneer sommige ontwerppunten (recepten) leiden tot mislukte formuleringen, maken ruimtevullende ontwerpen het mogelijk om de faalgrens over de studiefactoren te modelleren, terwijl ook statistische modellen voor de studieresponsen over de succesvolle factorcombinaties worden ondersteund. Ten slotte maakt de binnendekking van de factorruimte modelonafhankelijke grafische verkenning van het responsoppervlak mogelijk.
Om de mengselfactorsubruimte van een mengselprocesexperiment te visualiseren, worden gespecialiseerde driehoekige "ternaire percelen" gebruikt. Figuur 1 motiveert dit gebruik: in de kubus van punten waar drie ingrediënten elk van 0 tot 1 mogen variëren, worden de punten die voldoen aan een beperking dat de som van de ingrediënten gelijk is aan 1 rood gemarkeerd. De mengselbeperking op de drie ingrediënten reduceert de haalbare factorruimte tot een driehoek. In LNP-toepassingen met vier mengselingrediënten produceren we zes verschillende ternaire plots om de factorruimte weer te geven door twee lipiden tegelijk uit te zetten tegen een "Anderen" -as die de som van de andere lipiden vertegenwoordigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65200/65200fig01.jpg"> Figuur 1: Driehoeksfactorgebieden. In de ruimtevullende plot in de kubus vertegenwoordigen de kleine grijze stippen formuleringen die niet consistent zijn met de mengselbeperking. De grotere rode punten liggen op een driehoek die in de kubus is ingeschreven en vertegenwoordigen formuleringen waarvoor aan de mengselbeperking is voldaan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65200/65200fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Naast de lipidemengselfactoren zijn er vaak een of meer continue procesfactoren zoals N:P-verhouding, bufferconcentratie of stroomsnelheid. Categorische factoren kunnen aanwezig zijn, zoals ioniseerbaar lipidentype, helperlipidentype of buffertype. Het doel is om een formulering te vinden (een mengsel van lipiden en instellingen voor procesfactoren) die een zekere mate van potentie maximaliseert en / of fysiochemische kenmerken verbetert, zoals het minimaliseren van deeltjesgrootte en PDI (polydispersiteitsindex), het maximaliseren van procentuele inkapseling en het minimaliseren van bijwerkingen - zoals gewichtsverlies - in in vivo studies. Zelfs wanneer wordt uitgegaan van een redelijk benchmarkrecept, kan er interesse zijn in heroptimalisatie gezien een verandering in de genetische lading of bij het overwegen van veranderingen in de procesfactoren of lipidetypen.
Cornell7 biedt een definitieve tekst over de statistische aspecten van mengsel- en mengselprocesexperimenten, waarbij Myers et al.9 een uitstekende samenvatting geven van de meest relevante mengselontwerp- en analyseonderwerpen voor optimalisatie. Deze werken kunnen wetenschappers echter overladen met statistische details en met gespecialiseerde terminologie. Moderne software voor het ontwerpen en analyseren van experimenten biedt een robuuste oplossing die de meeste LNP-optimalisatieproblemen voldoende ondersteunt zonder een beroep te hoeven doen op de relevante theorie. Hoewel meer gecompliceerde of prioritaire studies nog steeds baat zullen hebben bij samenwerking met een statisticus en optimale in plaats van ruimtevullende ontwerpen kunnen gebruiken, is ons doel om het comfortniveau van wetenschappers te verbeteren en optimalisatie van LNP-formuleringen aan te moedigen zonder een beroep te doen op inefficiënte one-factor-at-a-time (OFAT) testen11 of gewoon genoegen te nemen met de eerste formulering die voldoet aan de specificaties.
In dit artikel wordt een workflow gepresenteerd die statistische software gebruikt om een generiek LNP-formuleringsprobleem te optimaliseren, waarbij ontwerp- en analyseproblemen worden aangepakt in de volgorde waarin ze zullen worden aangetroffen. In feite zal de methode werken voor algemene optimalisatieproblemen en is niet beperkt tot LNP's. Onderweg worden verschillende veelgestelde vragen die zich voordoen behandeld en worden aanbevelingen gedaan die zijn gebaseerd op ervaring en op simulatieresultaten12. Het recent ontwikkelde raamwerk van zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM)13 heeft de anders fragiele benadering van het analyseren van resultaten van mengselprocesexperimenten sterk verbeterd, en we gebruiken deze aanpak om een vereenvoudigde strategie voor formuleringsoptimalisatie te bieden. Hoewel de workflow is opgebouwd op een algemene manier die kan worden gevolgd met behulp van andere softwarepakketten, is JMP 17 Pro uniek in het aanbieden van SVEM samen met de grafische samenvattingstools die we nodig hebben gevonden om de anders geheimzinnige analyse van mengselprocesexperimenten te vereenvoudigen. Als gevolg hiervan zijn JMP-specifieke instructies ook opgenomen in het protocol.
SVEM maakt gebruik van dezelfde lineaire regressiemodelbasis als de traditionele benadering, maar het stelt ons in staat om vervelende wijzigingen te voorkomen die nodig zijn om een "volledig model" van kandidaat-effecten te passen door een voorwaartse selectie of een bestrafte selectie (Lasso) basisbenadering te gebruiken. Bovendien biedt SVEM een verbeterde "gereduceerde model" -pasvorm die het potentieel voor het opnemen van ruis (proces plus analytische variantie) die in de gegevens wordt weergegeven, minimaliseert. Het werkt door het gemiddelde te nemen van de voorspelde modellen die het resultaat zijn van het herhaaldelijk herwegen van het relatieve belang van elke run in het model 13,14,15,16,17,18. SVEM biedt een raamwerk voor het modelleren van mengselprocesexperimenten dat zowel gemakkelijker te implementeren is als traditionele single-shot regressie en betere kwaliteit optimale formuleringskandidaten oplevert12,13. De wiskundige details van SVEM vallen buiten het bestek van dit artikel en zelfs een vluchtige samenvatting buiten het relevante literatuuronderzoek zou afleiden van het belangrijkste voordeel in deze toepassing: het maakt een eenvoudige, robuuste en nauwkeurige klik-en-klaar-procedure voor beoefenaars mogelijk.
De gepresenteerde workflow is consistent met de Quality by Design (QbD)19-benadering van farmaceutische ontwikkeling20. Het resultaat van de studie zal een goed begrip zijn van de functionele relatie die de materiaalattributen en procesparameters koppelt aan kritische kwaliteitsattributen (CQAs)21. Daniel et al.22 bespreken het gebruik van een QbD-framework specifiek voor RNA-platformproductie: onze workflow kan binnen dit kader als hulpmiddel worden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>JMP Pro 17.1</td><td>JMP Statistical Discovery LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een workflow voor lipide nanodeeltjes (lnp) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (svem)

A Workflow for Lipid Nanoparticle (LNP) Formulation Optimization using Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Models (SVEM)

We presenteren een Quality by Design (QbD) -achtige aanpak voor het optimaliseren van lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringen, met als doel wetenschappers een toegankelijke workflow te bieden. De inherente beperking in deze studies, waarbij de molaire verhoudingen van ioniseerbare, helper- en PEG-lipiden tot 100% moeten oplopen, vereist gespecialiseerde ontwerp- en analysemethoden om aan deze mengselbeperking tegemoet te komen. Door ons te concentreren op lipide- en procesfactoren die vaak worden gebruikt bij LNP-ontwerpoptimalisatie, bieden we stappen die veel van de problemen vermijden die zich traditioneel voordoen bij het ontwerp en de analyse van mengselprocesexperimenten door gebruik te maken van ruimtevullende ontwerpen en gebruik te maken van het onlangs ontwikkelde statistische kader van zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM). Naast het produceren van kandidaat-optimale formuleringen, bouwt de workflow ook grafische samenvattingen van de aangepaste statistische modellen die de interpretatie van de resultaten vereenvoudigen. De nieuw geïdentificeerde kandidaatformuleringen worden beoordeeld met bevestigingsruns en kunnen optioneel worden uitgevoerd in het kader van een uitgebreidere tweedefasestudie.

Deze benadering is gevalideerd voor beide breed geclassificeerde lipidentypen: MC3-achtige klassieke lipiden en lipidoids (bijv. C12-200), over het algemeen afgeleid van combinatorische chemie. Vergeleken met een benchmark LNP-formulering die is ontwikkeld met behulp van een One Factor at a Time (OFAT) -methode, vertonen de kandidaatformuleringen die via onze workflow worden gegenereerd vaak potentieverbeteringen van 4- tot 5-voudig op een logaritmische schaal, zoals weergegeven in de luciferasemetingen van de muizenleve...

Dit protocol biedt een benadering voor formuleringsoptimalisatie over mengsel-, continue en categorische studiefactoren die subjectieve keuzes in de experimentele ontwerpconstructie minimaliseren. Voor de analysefase wordt een effectieve en eenvoudig te gebruiken modelleringsprocedure gebruikt.

Een workflow voor lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM)

We present a Quality by Design (QbD) styled approach for optimizing lipid nanoparticle (LNP) formulations, aiming to offer scientists an accessible ...

Dit artikel biedt een workflow voor wetenschappers om een experimentele ontwerptabel te construeren en experimentele resultaten te analyseren over een verscheidenheid aan mengsel- en procesfactoren, zonder dat vervelende en potentieel vluchtige statistische beslissingen nodig zijn. De resulterende modellen kunnen gezamenlijk worden geoptimaliseerd over meerdere reacties en worden gebruikt om informatieve afbeeldingen te produceren om zowel het gezamenlijke responsoppervlak als de voorspellingen van de individuele reacties samen te vatten. Deze afbeeldingen zijn gemakkelijker te interpreteren dan de parameterschattingen uit de onderliggende statistische modellen en zijn nuttig bij het weergeven van de factorinstellingen die de meest wenselijke reacties produceren.Lipide- en nanodeeltjesformuleringswetenschappers moeten vaak nieuwe recepten maken voor verschillende payloads of bij het wijzigen van lipiden of procesinstellingen. We bieden een robuuste benadering van formuleringsoptimalisatie die de kans op fouten in de ontwerpconstructie minimaliseert en de noodzaak van uitgebreide statistische en kennis tijdens de analyse vermijdt. Vat het doel van het experiment samen in een document met datumstempel.Maak een lijst van de reacties die tijdens het experiment worden gemeten. Selecteer de factoren die gevarieerd zullen zijn en die constant zullen worden gehouden tijdens het onderzoek. Stel de bereiken vast voor de verschillende factoren en de relevante decimale precisie voor elk.Bepaal de grootte van het onderzoeksontwerp met behulp van de minimale en maximale heuristieken. Open sprong en navigeer door de menubalk naar DOI, Special Purpose, Space Filling Design. Voer de onderzoeksreacties in.Voer de studiefactoren en de bereiken in. Voer het vooraf bepaalde aantal runs voor het ontwerp in. Genereer de ontwerptabel voor het vullen van de ruimte voor de gekozen factoren en de rungrootte.Voeg een notitiekolom toe aan de tabel voor het annoteren van handmatig gemaakte uitvoeringen. Neem, indien van toepassing, handmatig benchmarkbesturingsruns op in de ontwerptabel. Voeg een replicatie toe voor een van de gecontroleerde benchmarks.Markeer de benchmarknaam in de kolom notities en kleur de markering van de rijen voor het repliceren van de benchmark voor eenvoudige correcte identificatie. Rond het mengsel van factorniveaus af tot de juiste granulariteit. Kopieer de afgeronde waarden en plak ze in de oorspronkelijke kolommen.Verwijder de overbodige kopieën van de afgeronde kolommen. Controleer na het afronden van de lipidenfactoren of hun som gelijk is aan 100%Als een rijsom niet gelijk is aan één, pas dan handmatig een van de mengselfactoren aan, zodat deze binnen het factorbereik blijft. Verwijder de somkolom nadat de aanpassingen zijn voltooid.Volg dezelfde procedure die wordt gebruikt voor het afronden van de mengselfactoren om de procesfactoren af te ronden op hun respectieve granulariteit. Maak de lipidekolommen zo op dat ze worden weergegeven als percentages met een gewenst aantal decimalen. Als u handmatige uitvoeringen zoals benchmarks hebt toegevoegd, wijzigt u de volgorde van de tabelrijen en voegt u een nieuwe kolom met afgeronde waarden toe.Sorteer deze kolom in oplopende volgorde door met de rechtermuisknop op de kolomkop te klikken en verwijder de kolom. Genereer ternaire plots om de ontwerppunten over de lipidefactoren te visualiseren. Onderzoek ook de run-verdeling over de procesfactoren.De formuleringswetenschappers moeten de haalbaarheid van alle runs bevestigen. Als er onhaalbare uitvoeringen bestaan, start u het ontwerp opnieuw op, rekening houdend met de nieuw ontdekte beperkingen. Voer het experiment uit in de volgorde die wordt opgegeven door de ontwerptabel.Noteer de uitlezingen in de kolom die in de experimentele tabel is ingebouwd. Plot de metingen en onderzoek de verdelingen van de antwoorden. Onderzoek de relatieve afstand tussen de kleurgecodeerde replicatieruns als er een is opgenomen, dit zorgt voor het begrip van het totale proces en de analytische variatie op de benchmark, vergeleken met de variabiliteit als gevolg van de veranderingen in de factorinstellingen over de hele factorruimte.Maak de pistes op een ternaire percelen. Kleur de punten volgens de antwoorden om een modelonafhankelijk beeld te krijgen van het gedrag over de mengselfactoren. Klik met de rechtermuisknop op een van de resulterende grafieken, selecteer Rijlegenda en selecteer vervolgens de antwoordkolom.Herhaal dit voor elke reactie. Bouw een onafhankelijk model voor elke respons als functie van de onderzoeksfactoren. Verwijder de modelscripts die zijn gemaakt door het ontwerp voor het vullen van de ruimte.Selecteer Analyseren, Model aanpassen. Construeer een volledig model met alle kandidaat-effecten. Dit model moet de belangrijkste effecten van elke factor omvatten, twee- en drieweginteracties, kwadratische en partiële kubische termen in de procesfactoren en Scheffe-kubieke termen voor de mengselfactoren.Selecteer alle studiefactoren. Wijzig de vermelding voor graad in drie van de standaardwaarde van twee. Selecteer vervolgens een Factorial to Degree.Selecteer alleen de niet-mengselfactoren en selecteer vervolgens Macro's, Partiële kubus. Selecteer alleen de mengselfactoren en selecteer vervolgens Macro's, Scheffe Cubic. Schakel de standaardoptie geen onderschepping uit.Geef de antwoordkolom op, wijzig de persoonlijkheid in gegeneraliseerde regressie. Sla dit model op in de gegevenstabel zodat u het eenvoudig kunt terugroepen. Selecteer Opslaan in gegevenstabel.Klik op Uitvoeren. Selecteer voor de schattingsmethode de optie SVEM Forward Selection. Vouw de menu's Geavanceerde besturingselementen forceren uit en schakel de selectievakjes uit die overeenkomen met de belangrijkste effecten van het mengsel.Alleen de Intercept-term blijft aangevinkt. Klik op Go.Plot de werkelijke reacties op basis van hun voorspelde reacties uit het SVEM-model om een redelijke voorspelbaarheid te verifiëren. Klik op het rode driehoekje naast SVEM Forward Selection en selecteer Kolommen opslaan, Voorspellingsformule opslaan.Hiermee wordt een nieuwe kolom gemaakt met de voorspellingsformule in de gegevenstabel Herhaal de modelbouwstappen voor elke reactie. Nadat alle reacties voorspellingskolommen hebben opgeslagen in de gegevenstabel, plot u de responstraceringen voor alle voorspelde responskolommen met behulp van een profilerfunctie. Selecteer Graph Profiler en selecteer alle voorspellingskolommen die in de vorige stap zijn gemaakt voor Y-voorspellingsformule, klik op OK.Identificeer de optimale formuleringen van kandidaten. Stel de wenselijkheidsfunctie voor elke reactie in, of deze moet worden gemaximaliseerd, geminimaliseerd of gekoppeld aan een doel. Dit houdt ook in dat de relatieve belangrijkheidsgewichten voor elke respons moeten worden ingesteld.Als u de eerste kandidaat wilt genereren, stelt u alle primaire antwoorden in op belangrijkheidsgewicht 1,0 en eventuele secundaire antwoorden op belangrijkheidsgewicht 0,2. Instrueer de profiler om de optimale factorinstellingen te vinden die de wenselijkheidsfunctie maximaliseren. Selecteer Optimalisatie wenselijkheid, Maximaliseer wenselijkheid.Noteer de optimale factorinstellingen samen met een opmerking over de belangrijkheidswegingen die voor elke respons worden gebruikt. Voor categorische factoren zoals het ioniseerbare lipidetype, vindt u de voorwaardelijk optimale formuleringen voor elk factorniveau. Stel eerst het gewenste niveau van elke factor in de profiler in.Houd vervolgens de control-toets ingedrukt en klik met de linkermuisknop in de grafiek van die factor en selecteer Lock Factor Setting. Deze selecte optimalisatie en wenselijkheid, maximaliseren de wenselijkheid om het voorwaardelijke optimum te vinden met deze factor opgesloten in de huidige instelling. Wanneer u klaar bent, ontgrendelt u de factorinstellingen voordat u doorgaat.Herhaal het optimalisatieproces na het wijzigen van de belangrijkheidsgewichten van de respons, misschien alleen het optimaliseren van de primaire reacties of het instellen van sommige van de secundaire reacties om meer of minder belangrijkheidsgewicht te hebben, waarbij hun doel op geen enkele wordt ingesteld. Leg de nieuwe optimale kandidaat vast. Maak grafische samenvattingen van de optimale gebieden van de factorruimte.Maak een gegevenstabel die 50.000 rijen bevat die zijn gevuld met willekeurig gegenereerde factorinstellingen binnen de toegestane factorruimte, samen met de bijbehorende voorspelde waarden uit de gereduceerde modellen voor elk van de antwoorden, evenals de gezamenlijke wenselijkheidsfunctie. Selecteer Willekeurige uitvoertabel. Wijzig de waarde van het aantal te simuleren runs in 50.000 en klik op OK.Voeg in de nieuw gemaakte tabel een nieuwe kolom toe die het percentiel van de gewenste kolom berekent. Gebruik deze percentielkolom in de ternaire plots in plaats van de onbewerkte wenselijkheidskolom. Klik met de rechtermuisknop op de kolomkop Wenselijkheid en selecteer Nieuwe formulekolom, Verdeling, Cumulatieve kans.Genereer de volgende afbeeldingen. Wijzig herhaaldelijk het kleurenschema van de afbeeldingen om de voorspellingen voor elke reactie en voor de kolom met cumulatieve waarschijnlijkheid weer te geven. Bouw ternaire percelen voor de vier lipidefactoren.Navigeer in de tabel naar de grafiek ternaire plot. Selecteer de mengselfactoren voor X-plotting en klik op OK. Klik met de rechtermuisknop in een van de resulterende grafieken, selecteer Rijlegende en selecteer vervolgens de kolom met voorspelde reacties.Wijzig de vervolgkeuzelijst kleuren in Jet. Dit toont de best en slechtst presterende regio's met betrekking tot de lipidefactoren. De huidige figuur toont de percentielen van de gezamenlijke wenselijkheid bij het overwegen van het maximaliseren van de potentie met een belangrijk vervolg op 1, en het minimaliseren van de grootte met een belangrijk vervolg op de 0,2.Terwijl het gemiddelde wordt genomen over alle factoren die niet op de ternaire plotas worden weergegeven. Wijzig herhaaldelijk het kleurenschema van de afbeeldingen om de voorspellingen voor elke reactie weer te geven. Plot op dezelfde manier de 50.000 kleurgecodeerde punten die unieke formuleringen vertegenwoordigen tegen de niet-mengselprocesfactoren, enkelvoud of gezamenlijk, en zoek naar relaties tussen de reacties en de factoren.Zoek naar de factorinstellingen die de puntenopbrengst in de hoogste wenselijkheid produceren. Deze figuur toont de gezamenlijke wenselijkheid van alle formuleringen die kunnen worden gevormd met elk van de drie geïoniseerde lipidetypen. De meest wenselijke formuleringen gebruiken H102, waarbij H101 enkele potentieel concurrerende alternatieven biedt.Onderzoek verschillende combinaties van factoren die tot verschillende reacties kunnen leiden. Sla de voorspellingsprofiler en de onthouden instellingen weer op in de gegevenstabel. Maak een tabel met de optimale kandidaten die eerder zijn geïdentificeerd.Voeg de benchmarkcontrole toe aan de set kandidaatruns die worden geformuleerd en gemeten. Als een van de formuleringen uit het experiment wenselijke resultaten bleek op te leveren, misschien door beter te presteren dan de benchmark, selecteert u de beste om toe te voegen aan de kandidaattabel en test u opnieuw samen met nieuwe formuleringen. Klik met de rechtermuisknop op de tabel met onthouden instellingen in de profiler en selecteer Maken in gegevenstabel.Voer de bevestigingsruns uit, construeer de formuleringen en verzamel de uitlezingen. Vergelijk de prestaties van de kandidaat optimale formuleringen. De workflow is in veel toepassingen gebruikt.In de meeste gevallen hebben we ten minste een vier tot vijf keer verbeterde potentie waargenomen wanneer we vergelijken met benchmarkformuleringen die zijn ingesteld met behulp van één factor tegelijk optimalisatie. Verbeteringen zijn vooral merkbaar wanneer secundaire reacties gezamenlijk worden gericht. Het is ook mogelijk om simulatie te gebruiken om de verwachte kwaliteit van de optimale kandidaten die door deze procedure worden geproduceerd, te laten zien.Met behulp van een bekende gegevensgenererende functie voor het voorbeeldexperiment dat in het artikel wordt beschreven, kunnen we de kwaliteit van de kandidaat-optimale formuleringen die zijn verkregen uit de ruimtevulontwerpen en op SVEM gebaseerde analyse die in deze workflow worden gebruikt, vergelijken met die verkregen uit de traditionele mengselanalysetechnieken. Met de kwaliteit van de optimale formulering weergegeven op de verticale as en het aantal runs in het ontwerp weergegeven op de horizontale as, vertegenwoordigen de blauwe punten de prestaties van het niet-gereduceerde volledige statistische model over 150 simulaties. De oranje punten vertegenwoordigen de prestaties van de traditionele single shot forward-selectie op basis van de AICC-doelfunctie.De groene punten vertegenwoordigen de prestaties van de op SVEM gebaseerde forward selectiebenadering die in deze workflow wordt gebruikt. De SVEM-analyse stelt ons in staat om betere optimale kandidaten en minder runs te verkrijgen. Er zullen af en toe studies zijn met extra complexiteit die de hulp van een statisticus vereisen voor ontwerp en analyse.Studies met een extreem hoge prioriteit, waarbij de run size beperkter is dan normaal, of er zijn een groot aantal categorische factoren, of een enkele categorische factor met een groot aantal niveaus, kan anders worden benaderd door een statisticus. Met behulp van optimale of hybride ontwerpen in plaats van het ruimtevullende ontwerp dat in de workflow is opgegeven.

a-workflow-for-lipid-nanoparticle-lnp-formulation-optimization-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide...

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

In deze studie werd een methode beschreven voor het synthetiseren van ultrakleine populaties van biocompatibele nanodeeltjes, evenals verschillende in vitro methoden om hun celinteracties te beoordelen.

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Microfluïdische productiemethoden voor lipide nanodeeltjes (LNP) hebben de aandacht getrokken in medicijnafgiftesystemen (DDS'en), waaronder RNA-afgifte. Dit protocol beschrijft de fabricage, LNP (siRNA-loaded LNP) productie en LNP evaluatie processen met behulp van ons originele microfluïdische apparaat genaamd iLiNP.

Productie van siRNA-geladen lipide nanodeeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het formuleren van lipide nanodeeltjes (LNP's) die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase. Deze LNP's werden in vitro getest op hun werkzaamheid in HepG2-cellen en in vivo in C57BL/6-muizen.

Testen van de in vitro en in vivo efficiëntie van mRNA-lipide nanodeeltjes geformuleerd door microfluïdische menging

Een gedetailleerd protocol voor het synthetiseren van lipide nanodeeltjes (LNP's) met behulp van CIJ-mixertechnologieën (Confined Impinging Jet), waaronder een CIJ met twee stralen en een vortexmixer met vier stralen met meerdere inlaten (μMIVM), wordt gedemonstreerd. De CIJ-mengers genereren reproduceerbare, turbulente micromengomgevingen, wat resulteert in de productie van monodisperse LNP's.

Het synthetiseren van lipide nanoparticles door turbulente stroming in besloten botsende straalmixers

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

De Miller-Urey experiment was een baanbrekende studie over de abiotische synthese van organische verbindingen met mogelijke relevantie voor de oorsprong van het leven. Eenvoudige gassen werden in een glazen apparatuur en onderworpen aan een elektrische ontlading, de gevolgen van de bliksem in de oer-aarde atmosfeer-oceaan systeem simuleren. Het experiment werd gedurende een week, waarna de verzamelde daaruit monsters werden geanalyseerd op de chemische bouwstenen van het leven.

Het uitvoeren van Miller-Urey experimenten

Synthetische eiwitsequenties gebaseerd op consensusmotieven negeren doorgaans co-evolerende residuen, die interpositionele afhankelijkheden (IPD's) impliceren. IPD's kunnen essentieel zijn voor activiteit, en ontwerpen die ze negeren, kunnen resulteren in suboptimale resultaten. Dit protocol gebruikt StickWRLD om IPD's te identificeren en helpt bij het informeren van rationeel eiwitdesign, wat resulteert in efficiëntere resultaten.

Optimalisatie van synthetische eiwitten: Identificatie van interpositioneel afhankelijkheden Indicating structureel en / of functioneel verbonden Residuen

Hier presenteren we een protocol voor de werking en optimalisatie van Active Flow Technology (AFT) kolom in Curtain flow (CF) modus voor verbeterde scheidingsprestaties.

Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Ontdek een workflow voor LNP-formuleringoptimalisatie met ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen. Deze methode minimaliseert statistische fouten en produceert informatieve graphics voor betere interpretatie van resultaten.

Een workflow voor lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM) (Video) | JoVE Journal

Een workflow voor lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM)

Meer video's verkennen