Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Het algemene doel van deze procedure is om ultrakleine populaties van biocompatibele nanodeeltjes te synthetiseren, hun fysische eigenschappen te karakteriseren en de interacties tussen deeltjes en cellen te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de fase-inversietemperatuurmethode te gebruiken om de lipidenanodeeltjes te synthetiseren. Tijdens dit proces worden het lipide en het oppervlakteactieve middel aanvankelijk samen gesmolten.

Na het toevoegen van een specifieke hoeveelheid water wordt het mengsel verwarmd totdat fasescheiding optreedt. Het mengsel wordt vervolgens continu geroerd totdat een nano-emulsie is gecreëerd en de synthese van vaste lipidenanodeeltjes of SLN is voltooid. Vervolgens wordt dynamisch lichtverstrooiing of DLS gebruikt om de deeltjesgrootte en polydispersiteit te meten.

Differentiële scanning calorimetrie of DSC is een aanvullende techniek die wordt gebruikt om het smeltpunt en de latente smeltwarmte te bepalen om de deeltjes verder te karakteriseren. Uiteindelijk kunnen fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie worden gebruikt om de interacties tussen deeltjes en cellen te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande hoogenergetische methoden zoals ultrasoon microfluïdisch en hogedruk homogenisatie, is dat dit een relatief zachte synthesetechniek is, die zowel eenvoudig als schaalbaar is. Om de LNS te synthetiseren, combineer je 0,6 milligram fluorescerende kleurstof of andere lipofiele verbinding en 0,10 gram van de lineaire alcaan of lipide.

In een 15 milliliter vial coremelt de componenten bij 90 graden Celsius en roer toe 0,11 gram van een lineaire niet-ionogene oppervlakteactieve stof. Dan smelt je het resulterende mengsel bij 90 graden Celsius en roer. Voeg vervolgens 1,79 gram steriel water toe aan het mengsel, verwarm het tot 90 graden Celsius en bewaak de oplossing visueel totdat twee fasen worden waargenomen.

Roer nu het mengsel totdat een transparante nano-emulsie is gevormd. Bereid parallel een afzonderlijke nano-emulsie zonder de fluorescerende kleurstof toe om als controlemonster te dienen. Steriliseer vervolgens elke nano-emulsie met behulp van een steriele 0,2 micron filter.

Gebruik DLS om de deeltjesgrootte en polydispersiteit van de SLN's te meten. Gebruik een glas in een instrument dat is ontworpen om de deeltjesgrootte te meten vóór de meting van de monsters. De deeltjesgrootte van twee bekende standaarden moet worden gemeten volgens het protocol van de fabrikant voor de voorbereiding en meting van de standaarden. Meet vervolgens de monsters zoals voorbereid voor elke. Gebruik een runtime van 100 seconden, de brekingsindex van water en de viscositeit van water bij 20 graden Celsius.

Rapporteer de gemiddelde deeltjesdiameter en polydispersiteit van de deeltjesgrootteverdeling om het thermische gedrag van de SLN's te onderzoeken met behulp van DSC. Pipetteers de SLN's eerst in een aluminium pan van 40 microliter met een massa van ongeveer 25 milligram. Sluit de pan hermetisch af met behulp van een universele krimppers om vochtverlies tijdens de DSC-scan te minimaliseren. Voordat u elke nano-emulsie meet van vijf tot 80 graden Celsius, rapporteert u het smeltpunt en de latente smeltwarmte uit het DSC-diagram waarbij de vallei het smeltpunt vertegenwoordigt en de integraal van het gebied onder de curve.

In het DSC-diagram, gedeeld door de hoeveelheid materiaal, vertegenwoordigt de latente smeltwarmte cultuur. Primaire menselijke fibroblasten volgens de instructies van de fabrikant in vloeibaar medium voor de cultuur van humane dermale fibroblasten. Aangevuld met de kit voor groeisupplement met laag serumgehalte, bewaar de cellen in een bevochtigde atmosfeer bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en subcultureer bij het bereiken van 80% confluency voor zowel MTT- als beeldanalyse. Zaai cellen.

In een 96-wellsplaat met een dichtheid van 20.000 cellen per well. Laat de cellen overnacht bij 37 graden Celsius gelijkwaardig worden voordat de blootstelling aan SLN plaatsvindt bij tijd nul. Verdun de SLN's in compleet medium om de gewenste lipidenconcentratie te bereiken en voeg 10 microliter per well toe aan elke replicaatwell in de 96-wellsplaat. Na 24 uur incubatie met SLN's bepaal je de cellulaire levensvatbaarheid met behulp van de MTT-test volgens het protocol van de fabrikant. Was de cellen eenmaal en voeg 100 microliter vers medium toe aan elk.

Dood de controlewells af door ze 10 minuten in een 70% methanoloplossing te incuberen voordat je ze vervangt door vers medium. Voeg het MTT-reagens toe met 10 microliter per well in elke well van de microplaat en incubeer overnacht bij 37 graden Celsius. Na overnachtelijke incubatie, solubiliseer de intracellulaire vorm en kristallen met 100 microliter van de meegeleverde detergentoplossing. Volg het protocol van de fabrikant en incubeer de cellen gedurende drie uur bij kamertemperatuur voordat je absorptiewaarden verkrijgt.

Gebruik een microplaatlezer om je voor te bereiden op microscopie. Was de fibroblasten twee keer met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing. Fixeer de cellen gedurende 10 minuten met koud, 70% methanol op specifieke tijdstippen na het doseren van fibroblasten met lns.

Na 10 minuten, vervang je het methanol door fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS voordat je afbeeldingen vastlegt met behulp van een omgekeerde microscoop. De gesynthetiseerde S SLN resulteerde in controle S LNS met een gemiddelde deeltjesdiameter van 18,59 en met een polydispersiteit van 5,83 en Nile red geladen SLN's met een gemiddelde deeltjesdiameter van 16,87 nanometer en met een polydispersiteit van 4,47 met behulp van een MTT-test. Het dosisresponseffect op cellulair metabolisme werd gemeten waarbij een toename van de deeltjesconcentratie resulteerde in een afname van de cellulaire levensvatbaarheid.

Er werd geen verschil in toxiciteit waargenomen tussen cellen die werden blootgesteld aan SLN alleen versus Nile red geladen SLN. In parallel werden cellen visueel onderzocht op hechting aan het weefselkweekmedium. Polystyreen en er werden afbeeldingen gemaakt om zowel representatieve cellulaire mor