Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën
September 25th, 2023
We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.
Bij bacteriën vereist de studie van de dynamiek van celdelingseiwitten een ruimtelijke oriëntatie van de cellen. In het geval van de Z-ring, het hoofdbestanddeel van bacteriële celdeling, is een verticale oriëntatie bijvoorbeeld fundamenteel om de hele structuur in het XY-vlak vast te leggen. In deze video ontwikkelen we een methode om deze specifieke oriëntatie te bereiken in de filamenteuze cyanobacteriën Anabaena.
Anabaena is een meercellig fotosynthetisch organisme en deelt met andere bacteriën het vermogen om atmosferische dinitrogen als stikstofbron te gebruiken. Bij afwezigheid van dit element differentiëren Anabaena cellen die gespecialiseerd zijn in stikstoffixatie. Daarom biedt het een uitstekend model om de relatie tussen cellulaire deling en meercelligheid te analyseren.
Selecteer eerst een divisoomcomponent die aanwezig is in de doelfilamenteuze cyanobacteriestam. Voor het experiment is het noodzakelijk om een filamenteuze cyanobacteriële mutant te construeren die de geselecteerde divisoomcomponent tot expressie brengt die is gefuseerd met een fluorescerend eiwit. In dit protocol gebruiken we een Anabaena-mutant die FtsZ uitdrukt gefuseerd met GFP als voorbeeld.
Maak eerst een nieuwe subcultuur van de mutant met 10 milliliter van een cultuur in stationaire fase en 90 milliliter vloeibaar medium. Laat vervolgens de nieuwe celcultuur groeien in constant licht en bij de optimale temperatuur, totdat de exponentiële fase wordt bereikt. In ons voorbeeld werd de mutant zeven dagen lang gekweekt bij 25 graden Celsius.
Neem nu twee milliliter van de groeicultuur en doe deze in een centrifugebuis. Centrifugeer op 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Controleer na de centrifugatie of alle cellen zich op de bodem van de buis bevinden.
Wees voorzichtig bij het hanteren van de monsters om te voorkomen dat u opnieuw suspensie gebruikt. Verwarm de agarose-oplossing met een laag smeltpunt in een magnetron. Het is belangrijk om dit in korte tijdsintervallen te doen en de oplossing te controleren totdat deze volledig vloeibaar is.
Zodra het is gesmolten, zet het opzij om af te koelen. Neem de centrifugebuizen van de vorige stap, gooi 1,9 milliliter van het supernatant weg en suspensie de cellen opnieuw in het resterende volume door minstens drie keer op en neer te pipetteren. Plaats op uw werkplek de buis met de cellen, de gesmolten agarose-oplossing, een spuit van één milliliter in de punt gesneden en een scalpel met een nieuw en schoon mes.
Meng vervolgens de cellen met 900 microliter van de 3% agarose-oplossing door minstens drie keer te pipetteren. Het is echt belangrijk om ervoor te zorgen dat de agarose-oplossing niet te heet is, maar vloeibaar blijft. Hiermee voorkomen we celschade tijdens dit proces.
De volgende stap moet snel worden gedaan en voordat de agarose-oplossing gelifieert. Zuig de agarosematrix voorzichtig op in een spuit van één milliliter. Het is belangrijk om het genereren van bubbels te voorkomen terwijl het monster wordt opgezogen.
Incubeer daarna het monster en plaats de spuit gedurende twee uur in horizontale positie bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie voorzichtig de matrix met de cellen met behulp van de zuiger in een schoon en vlak oppervlak. Snijd het gelmonster met behulp van het scalpel in plakjes zo dun mogelijk, waarbij de integriteit van de matrix behouden blijft.
Deponeer vervolgens de monsters in de bijbehorende coverslip, naast elkaar. Zoals te zien is in de video, kunt u in deze stap een tip gebruiken om te helpen bij het verwerkingsproces van het monster. Voor time-lapse-experimenten wordt het gebruik van een celkamer voor microscopie-analyse aanbevolen.
In dit geval gebruiken we ronde coverslips die in dit soort kamers passen, zoals je in de video kunt zien. Ten slotte, om uitdroging van het monster te voorkomen, voegt u een extra volume gesmolten 3% agarose-oplossing toe in de kamer. Wacht voor de beeldvorming tot de agarose volledig gelated is.
Plaats nu de kamer met de cellen in de microscoop voor beeldvorming. Het is aan te raden om een apparaat te gebruiken met temperatuur- en vochtigheidsregeling. Visualiseer het monster in een helder veld met maximale vergroting en zoek een verticaal georiënteerde gloeidraad.
U kunt de divisiesite van belang vinden met een eerste scan met behulp van het autofluorescentiesignaal langs het Z-vlak. Gebruik hiermee de parameters van uw fluorescerende eiwitmarker om het signaal van uw eiwit van belang in de delingsplaats te visualiseren. Nu kunt u time-lapse-experimenten uitvoeren volgens het biologische model en het eiwit van belang.
In dit geval kunnen we de hele structuur van de Z-ring zien in de FtsZ-GFP-mutant, in het XY-vlak. Met onze methode waren we in staat om de dynamiek van deze ringen in een lange periode vast te leggen. Ten slotte concluderen we met de veranderingen in fluorescentie-intensiteit dat deze structuur zeer dynamisch is in ons model.
Deze methode is een snel en goedkoop protocol om de eiwitdynamica in de delingsplaats te registreren door middel van confocale microscopie toegepast op complexe morfologieën als filamenteuze cyanobacteriën, met Anabaena als model.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een innovatieve methode voor het visualiseren van filamenteuze cyanobacteriën in een verticale oriëntatie, waardoor gedetailleerde observatie van celdelingsproteinen, met name de Z-ring structuur, mogelijk wordt. Door gebruik te maken van het cyanobacterium Anabaena als model, toont de methode aan hoe effectief fluorescerende markers kunnen worden toegepast om dynamica in complexe multicellulaire vormen te bestuderen.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Celdeling
- Cyanobacteriële biologie
- Fluorescente microscopie
Achtergrond
- Anabaena zijn multicellulaire fotosynthetische organismen die in staat zijn tot stikstofbinding.
- Het begrijpen van eiwitdynamica in cyanobacteriën kan inzichten geven in celdeling en multicellulariteit.
- Een ruimtelijke oriëntatie in beeldvorming is cruciaal voor het vastleggen van complete structuren zoals de Z-ring.
Gebruikte methoden
- Fluorescerende proteïne-tagging van de divisoomcomponent FtsZ
- Filamenteus cyanobacteriën modelsysteem (Anabaena)
- Confocale microscopie voor beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- De dynamica van de Z-ring structuur werd succesvol gevisualiseerd in het XY-vlak.
- De methode toonde hoge temporele resolutie en maakte continue observatie van eiwitgedrag mogelijk.
- Resultaten bevestigden de dynamische aard van de Z-ring tijdens celdeling.
Conclusies
- Deze methode faciliteert de studie van eiwitdynamica in filamenteuze organismen en biedt een toepasbaar kader voor verschillende filamenteuze soorten.
- De bevindingen dragen bij aan een bredere begrip in celbiologie en microscopiemethodologieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse imaging of protein dynamics in complex bacterial systems is critical for de-risking early discovery and validating division-related targets. The vertical immobilization method for filamentous cyanobacteria enables direct visualization of Z-ring assembly and dynamics, supporting predictive confidence in mechanistic studies. This capability strengthens the translational bridge from basic cell biology to applied microbial engineering and synthetic biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell division protein dynamics in multicellular bacterial models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing FtsZ Z-ring formation and behavior in vivo.
- Facilitates functional validation of division-related targets in genetically engineered strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, vertically oriented biological samples for quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample orientation and imaging conditions.
- Enables robust, time-lapse readouts for screening division-modulating compounds in complex morphologies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant or industrially relevant multicellular bacterial systems.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical microbial engineering applications.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for biotechnological use.
Pipeline & Workflow Integration
This vertical immobilization protocol fits at the interface of early discovery and assay development, enabling high-content imaging from target validation through preclinical microbial model evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on division protein function and spatial organization in multicellular bacteria.
- Screening: Delivers standardized, reproducible sample preparation for quantitative imaging assays.
- Analytics: Provides time-resolved, quantitative fluorescence measurements of protein dynamics at division sites.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical microbial engineering and synthetic biology workflows.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, low-cost method adaptable to diverse filamentous bacterial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in division protein function and target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for microbial engineering and synthetic biology initiatives.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of division-targeted interventions and engineered strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and fluorescent protein engineering.
- Needs access to temperature- and humidity-controlled imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various filamentous bacterial models with appropriate genetic tools.
- Sample orientation and handling are critical for reproducible, high-content imaging outputs.
