Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

Ons onderzoek heeft tot doel twee kritieke biofysische eigenschappen van pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te meten, die kunnen worden verkregen door normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren in een lucht-vloeistofinterface. We identificeerden verschillende kenmerken van verschillende respiratoire virussen door gebruik te maken van pseudogestratificeerd luchtwegepitheel. Bijvoorbeeld respiratoir syncytieel virusgedreven cytoskeletale ontsteking, wat een niet-canoniek mechanisme is van bronchiolitis.

We hebben ook vastgesteld dat slijmbekercelhyperplasie de SARS-CoV-2-replicatie verhoogt in het luchtwegepitheel van chronische obstructieve longziekte. We hebben ons gericht op het ophelderen van het mechanisme van respiratoire syncytiële virusgestuurde modulatie van cytoskeletale signalering om nieuwe therapeutische doelen te identificeren om RSV-infectie en virusgeïnduceerde bronchiolitis te bestrijden. Neem om te beginnen een normale menselijke bronchiale epitheliale of NHBE-celsuspensie.

Voeg met een P200-pipet 50.000 geresuspendeerde cellen toe in 200 microliter volledige luchtwegepitheelcel, of AEC, medium aan de apicale zijde van het inzetstuk. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 85%tot 95% bevochtigde kooldioxide-celcultuurincubator. Zodra de cellen samenvloeien, brengt u de inserts over naar een leeg putje met behulp van een steriele tang.

Zuig met een P1000-pipet al het basale AEC-medium op. Voeg vervolgens 500 microliter vers compleet ALI-differentiatiemedium aangevuld met 2% penicilline-streptomycine en 1% amfotericine B toe aan de basale put. Breng met een steriele tang de inserts over naar de basale put met het toegevoegde volledige ALI-medium.

Zuig met een P200-pipet voorzichtig het apicale AEC-medium uit de put op en incubeer het. Breng de inserts na 48 uur met een steriele tang over in een leeg putje. Zuig met een P1000-pipet het oude medium op en voeg 500 microliter vers compleet ALI-medium toe.

Plaats de inzetstukken terug in het putje met vers medium met behulp van een steriele tang. Voeg op dag 26 met behulp van een P200-pipet 100 microliter DPBS toe aan de apicale zijde van de inzetstukken. Incubeer 30 minuten bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celkweekbroedmachine.

Zuig vervolgens de DPBS op met een P200-pipet. Schakel om te beginnen de microscoop, de aangesloten computer en de omgevingskamer in. Open de kamerdeur en plaats de plaat met de inzetstukken met NBHE-cellen op de microscooptafel.

Zodra de plaat op het podium staat, sluit je de kamer. Gebruik vervolgens de bedieningsknop van de microscooptafel om de plaat te verplaatsen en de inzetstukken in beeld te brengen. Klik op het computerscherm op het SAVA-systeempictogram om het SAVA-programma te openen.

Klik in de software-interface op Experiment configureren. Klik op het volgende tabblad op Experiment maken. Voer vervolgens op het nieuwe tabblad de map in waarin de gegevens worden opgeslagen in het veld Mapnaam voor experiment invoeren en geef details op in het veld Experimentbeschrijving invoeren en klik vervolgens op OK. Klik nu op het experiment dat is gemaakt en wordt weergegeven in de map onder het gedeelte Experimenten.

Klik daarna op Wijzigen en geef voorbeelddetails op in het veld Voorbeeldbeschrijving. Klik op Toevoegen en klik vervolgens op Afsluiten om het tabblad te verlaten. Selecteer in de hoofdsoftware-interface het gemaakte experiment in de vervolgkeuzelijst in de experimentsleuf.

Klik vervolgens op Video opnemen om de ciliaire beatfrequentie op het computerscherm te controleren. Het scherm toont een gefocuste ciliaire beweging. Neem voor elke invoeging zes verschillende willekeurige velden op gedurende 2,1 seconde met 120 frames per seconde.

Klik op Video opslaan om de gegevens van de ciliaire beatfrequentie te controleren. Om gegevens te analyseren, klikt u op Video analyseren op de software-interface. En klik op het volgende tabblad op OK. Ga dan naar het volgende tabblad en klik op Alles analyseren.

Download de spreadsheet die voor elk experiment is gegenereerd in de map SAVA Data Acquisition van de computer. Neem de Gaussiaanse gemiddelde frequentie voor de presentatie van gegevens. De ciliaire slagfrequentie bereikte ten minste drie hertz voor zowel het luchtwegepitheel van gezonde volwassenen als mensen met COPD, met een vergelijkbare ciliaire functie.

Schakel om te beginnen de EVOM2 volt ohmmeter in met behulp van de aan/uit-schakelaar. Sluit de testweerstand aan op de EVOM2 in de ingangssleuf. Bewaak de meting op het EVOM2-scherm.

Als de meting hoger of lager is dan 1.000, draait u de ADJ-schakelaar op de EVOM2 met een tang totdat deze een uniforme waarde van 1.000 weergeeft om het apparaat te kalibreren. Neem nu een leeg inzetstuk voor de experimentele controlemeting. Voeg met behulp van een P200-pipet 100 microliter DPBS toe aan de apicale zijde van het lege inzetstuk.

Voeg vervolgens 500 microliter DPBS toe aan de basale zijde met een P1000-pipet. Koppel daarna de testweerstand los en sluit de STX2-elektrode aan op de ingangssleuf op de EVOM2. Reinig vervolgens de STX2-elektrode voorzichtig met 70% ethanol.

Steek de STX2-elektrode in het lege inzetstuk met DPBS, waarbij u het kortere elektrodebeen op het apicale deel en het langere elektrodebeen op het basale deel houdt. Noteer nu de stabiele meting op het EVOM2-scherm. Voeg vervolgens met behulp van een P200-pipet 100 microliter DPBS toe aan de apicale zijde van het inzetstuk.

Steek de STX2-elektrode in het inzetstuk met het 26-daagse gedifferentieerde luchtwegepitheel, zoals eerder weergegeven. Noteer vervolgens de stabiele meting op het EVOM2-scherm. Transepitheliale elektrische weerstandswaarden namen toe bij volwassenen met COPD, wat wijst op verbeterde membraanondoordringbaarheid bij COPD.