Name: Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer de eSPAN-methode voor strandspecifieke analyse van histoonrecycling tijdens DNA-replicatie in gist en muizenembryonale stamcellen. Deze techniek onthult dynamische mechanismen van epigenetische overerving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) en de Hormel Startup Fund (C.Y.).

OPMERKING: Voor richtlijnen voor de voorbereiding van buffer en reagens, zie richtlijnen voor de voorbereiding van buffer en reagens (Aanvullend bestand 1).
1. Histone eSPAN in knopgist
OPMERKING: De meeste giststammen missen een functionele nucleoside transporter voor thymidineopname. Om DNA efficiënt te labelen met BrdU of EdU voor eSPAN, is een thymidine kinase-positieve (TK+) stam21 vereist. Bovendien kunnen alleen giststammen van het type 'A' worden gebruikt voor celcyclusarrest met behulp van alfa-factor.
<ol>
	<li>Gistcelsynchronisatie en BrdU-labeling (8 u)
	<ol>
		<li>Een enkele kolonie van een geschikte giststam (TK+) inoculeren in 10 mL YPD-medium en overnacht laten groeien bij 30 °C op een schuddende incubator bij 220 rpm.</li>
		<li>De optische dichtheid, OD600 nm, meten met een spectrofotometer en de cultuur verdunnen in vers 200 mL YPD-medium met OD600 ~0.2-0.3.</li>
		<li>De cultuur laten groeien tot OD600 ~0.4-0.5 (gewoonlijk duurt dit 3-4 u) bij 30 °C in een schuddende incubator bij 220 rpm.</li>
		<li>300 μL α-factor (5 mg/mL) toevoegen en 1.5 u laten kweken bij 25 °C, 220 rpm.</li>
		<li>Nog een dosis van 300 μL α-factor (5 mg/mL) toevoegen en nog 1.5 u laten groeien bij 25 °C, 220 rpm.</li>
		<li>De 37,5% paraformaldehyde-fixeringsoplossing voorbereiden en het medium voorverwarmen (200 mL YPD +HU (hydroxyureum)+ BrdU) tot 30 °C tijdens de celsynchronisatie. 
		VOORZICHT: Omdat BrdU een potentieel mutageen en teratogeen is, dient het met zorg te worden behandeld. Bereid een 37,5% paraformaldehyde-oplossing in een chemisch afzuigkap voor om blootstelling aan schadelijke dampen te voorkomen, aangezien paraformaldehyde een potentieel carcinogeen is.</li>
		<li>Controleer de morfologie van de cellen (een staafvorm) met een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat ten minste 90% van de gistcellen zich in de G1-fase bevindt 15 min voor de G1-arrest. Als alternatief kan flowcytometrieanalyse (FACS) worden uitgevoerd om G1-arrest te bevestigen24. 
		OPMERKING: Controleer de celmorfologie en bevestig G1-arrest (90% met een staafvorm) in deze stap.</li>
		<li>De cellen (pellet) verzamelen door centrifugatie bij 1600 g gedurende 5 min bij 4 °C en de celpellet tweemaal wassen met 20 mL ijskoud tweevoudig gedestilleerd water.</li>
		<li>De cellen resuspenderen in voorverwarmd (30 °C) 200 mL YPD +HU+ BrdU. 
		OPMERKING: Het doel van de HU-release is om ervoor te zorgen dat de meeste gistcellen zich in de vroege replicatie-S-fase bevinden, wat de consistentie zal verbeteren en de reproduceerbaarheid van de resultaten zal garanderen. Het weglaten van HU is acceptabel als het werken met logfase-cellen vereist is.</li>
		<li>De cellen kweken op een schuddende incubator bij 30 °C, 220 rpm gedurende 45 min. 
		OPMERKING: FACS-analyse kan worden uitgevoerd om de vroege S-fase te bevestigen. Voor FACS-analyse is het belangrijk om een log-fase-monster op te nemen als controle om de G1-celpopulatie nauwkeurig te definiëren. Voor efficiënte BrdU-incorporatie is het voordelig om te beginnen met snelgroeiende cellen. Sommige mutanten met langzame groeitempten hebben de neiging om een slechte BrdU-labelingsefficiëntie te vertonen. De efficiëntie van BrdU-incorporatie en de prestaties van BrdU-IP worden beoordeeld door kwantitatieve PCR door gerepliceerde en ongerepliceerde regio's te vergelijken22 met behulp van DNA geïsoleerd uit stap 1.6.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Staalfixatie en verzameling (1 u)
	<ol>
		<li>Voeg vers bereid 6 mL 37% paraformaldehyde toe om een ​​eindconcentratie van 1% te bereiken, goed mengen en 20 min incuberen bij 25 °C met zacht schudden, 90 rpm.</li>
		<li>De fixatie blussen door 12 mL 2,5 M glycijn toe te voegen, goed mengen en 5 min in te cuberen bij 25 °C met zacht schudden, 90 rpm.</li>
		<li>De cellen pelletten bij 1600 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT). Was de cellen vervolgens twee keer met 20 mL koud water door ze gedurende 5 min bij 1600 g te centrifugeren.</li>
		<li>Verzamel de cellen in 2 mL schroevendebuisjes (50 mL cellen/buisje) en bewaar ze bij -80 °C. 
		​OPMERKING: Cellen kunnen tot een jaar worden bewaard (pauzepunt).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gistcellyse en chromatinefragmentatie (5 u)
	<ol>
		<li>De cellenpellets ontdooien, door voorzichtig voortdraaien resuspenderen en wassen met 0,4 mL ChIP-lysebuffer met proteaseremmers en antibioticummix (om de groei van besmettende bacteriën te voorkomen) en centrifugeren bij 5 000 g gedurende 1 min.</li>
		<li>Voeg 0,1 mL ChIP-lysebuffer toe met proteaseremmers en een antibioticummix, gevolgd door ongeveer 100 μL glazen kralen (0,5 mm).</li>
		<li>Lyse door kralen te kloppen gedurende 3 cycli (30 s aan/uit, 1 min uit) in een koude kamer bij 4 °C.</li>
		<li>Maak gaten in de bodem van de buis met een 16 G hete naald. 
		OPMERKING: Om de hete naald te bewaren, probeer de buis dicht bij het vuur te houden.</li>
		<li>Verzamel het lysate door de buis in een 1,5 mL lege DNA-buis met lage binding te nestelen en centrifugeer

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Detectie van eiwitten geassocieerd met leidende en achterblijvende replicatiestrengen is belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van chromatine-replicatie en het bijbehorende proces, die direct relevant zijn voor menselijk kankeronderzoek en de mechanismen van geneesmiddelresistentie. Verschillende methoden, zoals 2D-gel, native Chromatine immunoprecipitatie(nChIP), iPOND en nascent chromatin capture29,30,31, zijn gebru...

In eukaryotische organismen wordt genoomduplicatie geïnitieerd vanuit meerdere locaties, replictie-oorsprong genoemd, waar het origin recognition complex (ORC) bindt en de recrutering van de eiwitmachinerie start, inclusief de CMG-helicase, om DNA-replicatie te initiëren1. De replisoommachinerie bij elke replictie-oorsprong vormt twee replicatiefoorken die bidirectioneel bewegen2,3. De tweeling-replicatiefoorken repliceren de twee ouderlijke DNA-strengen door de continue synthese van de leidende streng en discontinu synthese van de achterblijvende streng. Gezien deze asymmetrische aard van elke replicatiefoork, zijn de replicatiecomponenten, inclusief de DNA-polymerasen op de leidende en achterblijvende strengen, verschillend. Eerdere genetische analyse op basis van mutante DNA-polymerasen toont aan dat DNA Pol ε en DNA Pol δ de belangrijkste polymerasen zijn die verantwoordelijk zijn voor de replicatie van respectievelijk de leidende en achterblijvende streng4,5. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de strengvoorkeur van DNA-polymerase te detecteren, inclusief Pu-seq6,7, HydEn-seq8, en emRiboSeq of RiboSeq9,10. Deze genetische methoden om de strengspecificiteit te onderscheiden zijn beperkt tot DNA-polymerasen en vereisen het introduceren van mutaties in elk eiwit4,5,11,12. Het volgen van de associatie van een doeleiwit met leidende en achterblijvende strengen van DNA-replicatiefoorken zal waardevolle inzichten in DNA-replicatie opleveren. In dit verband ontwikkelden we eerst de eSPAN-techniek (verrijking en sequencing van eiwit-geassocieerd nasend DNA, Figuur 1) in gistcellen. Als een proof-of-principal studie toonden we eerst aan dat Pol δ en Pol δ verrijkt zijn op respectievelijk de leidende en achterblijvende strengen. We ontdekten ook de strengvoorkeur van belangrijke DNA-replicatiecomponenten, inclusief de replicatieve DNA-helicase, het enkelstrengs DNA-bindende eiwit (replicatie-eiwit A) en de proliferating cell nuclear antigen (PCNA) lamp en zijn loader replicatie factor C (RFC)13. Belangrijk is dat wij en anderen deze methode hebben gebruikt om mechanismen van parentaal histone transfer te onthullen, een proces dat meer dan 4 decennia lang ongrijpbaar was14,15,16,17.
De eSPAN-methode omvat twee opeenvolgende stappen: verrijking van het doeleiwit door ChIP18 of CUT&Tag19 en verrijking van het nasend DNA geassocieerd met het eiwit door BrdU immunoprecipitatie. In een standaard giststam (W303 of S288C) kunnen extracellulair BrdU of EdU niet in cellen binnendringen en zich in chromosomen incorporeren. Deze stammen missen een geschikte nucleoside transporter voor thymidine opname evenals de thymidine kinase die nodig is om thymidine te fosforyleren tot TMP, dat BrdU (of EdU) omzet in BrdUMP (EdUMP). Expressie van humaan equilibratief nucleoside transporter 1 (hENT1) en herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) verbetert de thymidine opname en de omzetting van BrdU (of EdU) naar BrdUMP (EdUMP)20. Daarom moesten de stammen voor het uitvoeren van het eSPAN-experiment in gist worden voorzien van een BrdU-Incorporerende (BrdU-Inc) structuur (HSV-TK en hENT1)13,21.
Eerder hebben we het eSPAN-protocol voor DNA-replicatie-eiwitten in gist geleverd22. Onlangs hebben we de CUT&Tag-methode geïntegreerd in het eSPAN-protocol in zoogdiercellen om technisch uitdagende stappen aan te pakken die optimalisatie vereisen, zoals cross-linking, chromatine-shearing, en om het aantal startcellen te minimaliseren17,23. Hier leverden we histone eSPAN voor visualisatie met behulp van gistcellen (Figuur 2). Deze methode wordt voornamelijk gebruikt om de distributie van gemodificeerde vormen van histonen op replicerende DNA-strengen te analyseren. Hoewel we verschillende histon-merken hebben getest, gebruikten we H3K4me3, een markering op de parentaal histone H3, als voorbeeld. Om replisoomcomponenten en factoren betrokken bij DNA-reparatie bij replicatiefoorken te analyseren, raden we aan chromatine in kleine fragmenten te sheren met behulp van sonicatie zoals beschreven in onze eerste publicatie22. Voor zoogdiercellen hebben we de gemodificeerde Cut&Tag-procedures geadopteerd om de ChIP-stap te vervangen zoals beschreven in gist23. Deze aanpassing vermindert de hoeveelheid startmateriaal (cellen) en, belangrijker nog, maakt de generatie van eSPAN-bibliotheken voor sequencing mogelijk zonder het gebruik van single-stranded DNA-voorbereidingskits. Voor het gistprotocol hebben we ervoor gekozen om de Cut&Tag-methode niet te gebruiken omdat de hoeveelheid startmateriaal voldoende was. Wat nog belangrijker is, vonden we dat de Cut&Tag-procedures niet consistent effectief waren voor gistcellen in onze handen.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA low-binding tubes&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10x Ampligase buffer</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S PLUS DNA LIBRARY KIT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>10009817</td><td>ssDNA and low-input DNA library prep kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>2100 bioanalyze</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Handle paraformaldehyde with care, it is flammable solid hazardous.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI Reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU antibody&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3 antibody&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Automated cell counter&nbsp;, model TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine Hydrochloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Combustible Solids</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Handle BrdU with care as it is a potential mutagen and teratogen.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; model Forma series II water-jacketed CO2 incubator</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell line ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash;400 dry mesh size</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA)-coated magnetic beads&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp;tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Handle ethanol with care, it is flammable</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Handle isoproponol with care, it is flammable</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>Handle KOH with care, it is corrosive</td></tr><tr><td>Low-speed vacuum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnet stand&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease&nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR purification kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beads beater</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Multiplatform shaker</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Multiplatform shaker incubator</td><td>Benchmark</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Multithermal heat block&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid&nbsp;(TAPS)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash;400 dry mesh size</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Handle NaOH with care, it is corrosive</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&times; PCR master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Thermo Scientific</td><td>J61055.AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyde</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>Handle paraformaldehyde with care, it is flammable solid hazardous.</td></tr><tr><td>pA-Tn5 enzyme&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-chloroform-isoamyl alcohol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P1000, P200, P20 and P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablet</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablet&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protein G-sepharose beads&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein precipitation solution</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Protein precipitation solution</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Handle KOH with care, it is corrosive</td></tr><tr><td>Protein precipitation solution&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma

strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van dna-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant dna-methode

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genoomduplicatie wordt geregeld door replisola-eiwitten, inclusief helicasen, die dubbelstrengs DNA ontwijnden in individuele antiparallelle enkele strengen, die elk verschillende replicatiemodi vereisen: continu (leidend) en ononderbroken (achterblijvend). Het begrijpen van de interacties van chromatine-geassocieerde eiwitten met replicerende DNA-strengen in vivo is cruciaal voor het verduidelijken van de mechanismen van chromatine-assemblage en DNA-reparatie gekoppeld aan DNA-replicatie. Dit protocol presenteert de verrijking en sequentie van eiwit-geassocieerd nasent DNA (eSPAN) methode, ontworpen om relatieve eiwitniveaus op nasent leidende en achterblijvende DNA-strengen op replicatievorken te kwantificeren. De eSPAN-procedure begint met chromatine-immunoprecipitatie (ChIP, in gist) of splitsing onder doelen en tagmentering (CUT&Tag; in zoogdiercellen) van een eiwit van belang, gevolgd door verrijking van het eiwit-geassocieerde nasent DNA door bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitatie. Strandelijk volgende generatie-sequencing wordt toegepast op geïsoleerde ssDNA. Deze techniek kan worden gebruikt om te bepalen of een eiwit is verrijkt op leidende of achterblijvende replicatievorken. De eSPAN biedt genoom-brede streng-voorkeur van chromatine-geassocieerde eiwitten, inclusief histonen op replicatievorken.

eSPAN kan worden gebruikt om streng-specifieke informatie over een doelwit-eiwit te verkrijgen, zoals histonen en histonmodificaties. In dit representatieve resultaat werden de monsterverzameling en eSPAN-processen uitgevoerd volgens het schema in Figuur 2 met behulp van het knopvormende gistsysteem. De monsterbehandeling en -verzameling volgen de hydroxyureum-behandelde vroege S-fase-voorwaarde zoals in dit protocol. Er werden twee giststammen gebruikt, WT (wild-type) en mcm2-3A mu...

Verrijking en sequentiebepaling van proteïne-geassocieerd nieuwvormings-DNA (eSPAN) is ontwikkeld om de relatieve abundantie van een chromatine-geassocieerd eiwit op twee replicerende DNA-strengen te detecteren, waardoor moleculaire inzichten in chromatine-replicatie en de gekoppelde processen worden onthuld. Dit protocol beschrijft eSPAN-procedures in gist- en muis embryonale stamcellen (ES).

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

In dit protocol beschrijven we een nieuwe BrdU-ChIP-Slot-Western techniek om eiwitten en histonmodificaties te onderzoeken die geassocieerd zijn met nieuw gesynthetiseerd of nagenoeg DNA.

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.

Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom

Leer de eSPAN-methode voor strandspecifieke analyse van histoonrecycling tijdens DNA-replicatie in gist en muizenembryonale stamcellen. Deze techniek onthult dynamische mechanismen van epigenetische overerving.

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode (Video) | JoVE Journal

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

Meer video's verkennen