Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Ons onderzoek richt zich op het mechanisme van epigenetische overerving. In het bijzonder is het DNA-replicatie-gekoppelde ouderlijke histonrecyclingproces, dat de eerste emitterende stap in epigenetische overerving vertegenwoordigt. Er werd vastgesteld dat meervoudige histonafzetting van ouders die betrokken zijn bij DNA-replicatie een belangrijke rol speelt bij het recyclen van ouderlijke histon.

Dit omvat het D-helicasecomplex, DNA-polymerase en replicatie voor beschermingscomplex. Traditionele genetische en biochemische benaderingen zijn waarden die in dit onderzoeksveld worden gebruikt. Traditioneel worden sequencingmethoden met hoge doorvoer gebruikt om het proces van ouderlijke histonoverdracht te begrijpen.

Voordat de verrijking en sequentiebepaling van eiwitgeassocieerd DNA, of experimentmethode, werd ontwikkeld, was het een uitdaging om het proces van ouderlijke histonoverdracht te bestuderen. De experimentmethode was een krachtig hulpmiddel om deze fundamentele vragen aan te pakken. Vijl om te beginnen de gistcelpellets en suspendeer ze opnieuw door middel van zachte vortex.

Was deze vervolgens met 0,4 milliliter CHIP-lysisbuffer met proteaseremmers en een antibioticamix om bacteriële besmetting te voorkomen. Centrifugeer het mengsel gedurende één minuut bij 5.000 G. Voeg vervolgens 0,1 milliliter CHIP-lysisbuffer met proteaseremmers en antibioticamix toe aan de pellet.

Gevolgd door ongeveer 100 microliter glaskralen van 0,5 millimeter. Lyseer de cellen door gedurende drie cycli kralen te kralen in een koelruimte van vier graden Celsius. Gebruik een 16 gauge hete naald om gaten in de bodem van de buis te prikken.

Verzamel het lysaat door de doorboorde buis te nesten in een lege DNA-buis met lage binding van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur bij 1.600 G. Zuig het bovenstaande voorzichtig op zonder de pellet te verstoren. De celrestfractie zal het chromatine bevatten.

Resuspendeer de celpellets door 0,35 milliliter gesupplementeerde microkokkennuclease of MNase-digestiebuffer in te pipetteren. Voeg vervolgens 10 eenheden MNase toe aan de suspensie. Meng voorzichtig door vier tot zes keer om te keren en incubeer gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius.

Blus de MNase-vertering door vijf microliter 0,5 molaire EDTA toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 10 millimolair. Meng voorzichtig door inversie en plaats de tube minimaal 30 minuten op ijs. Gebruik Bioruptor-microbuisjes van 1,5 milliliter om het reactiemengsel gedurende drie minuten op hoog vermogen te sonificeren met cycli van 30 seconden aan en 30 seconden uit.

Centrifugeer vervolgens vijf minuten bij 10.000 G bij vier graden Celsius. Breng het bovenstaande over in nieuwe buisjes en centrifugeer opnieuw bij 10.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel vervolgens ongeveer 400 microliter van het supernatant.

Bespaar 30 microliter als input-DNA voor DNA-extractie en vries in bij min 20 graden Celsius. Gebruik de resterende 370 microliter cellysaat voor histonchromatine-immunoprecipitatie. Kook om te beginnen ongeveer 150 microliter van de eerder verkregen input en H3K4me3 CHIP-monsters op een hitteblok van 100 graden Celsius Koel het monster gedurende vijf minuten onmiddellijk vijf minuten op ijs.

Voeg vervolgens de vereiste hoeveelheid van de genoemde componenten toe aan het monster. Muteer het monster gedurende twee uur op een rotor bij vier graden Celsius en 10 RPM. Breng het mengsel over in een tube van 1,5 milliliter met 20 microliter gewassen eiwit G Sepharose-korrels.

Muteer het mengsel gedurende een uur bij vier graden Celsius op de rotor bij 10 RPM. Centrifugeer de buizen gedurende één minuut bij kamertemperatuur op 800 G. Was de kralen drie keer met een milliliter koude broom-deoxyuridine of BrdU-immunoprecipitatiebuffer en roteer drie minuten voor elke wasbeurt.

Centrifugeer de buis opnieuw en was gedurende drie minuten met een milliliter TE-buffer. Draai de buisjes opnieuw gedurende één minuut op 800 G bij kamertemperatuur en zuig het bovenstaande voorzichtig op. Voeg 100 microliter TE-buffer met 1%SDS toe aan de kralen.

Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op 65 graden Celsius en draai vervolgens een minuut op kamertemperatuur op 800 G. Zuiver het bovenstaande tot 18 microliter elutiebuffer met behulp van DNA-zuiveringskolommen om de BrdU-immunoprecipitatie- en H3K4me3 eSPAN-monsters te verkrijgen. Bereid de enkelstrengs DNA-bibliotheek voor met de genoemde monsters volgens de handleiding van de ssDNA- en DNA-bibliotheek met weinig input.

Zuiver het ligatieproduct tot 20 microliter buffer met een laag EDTA-elutiegehalte. Versterk de DNA-bibliotheek met behulp van 50 microliter reactiemix uit de enkelstrengs DNA-bibliotheekvoorbereidingskit. Volg de weergegeven cyclus en versterk de PCR-mix.

Zuiver de PCR-producten door ze te mengen met 60 microliter kralen, voorverwarmd tot 30 graden Celsius. Meng de PCR-producten en -korrels grondig. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur staan.

Bind de kralen drie minuten op een magnetische standaard en was ze twee keer met 200 microliter vers bereide 80% ethanol. Laat de kralen twee minuten aan de lucht drogen en verdun het DNA tot 20 microliter buffer met een laag EDTA-gehalte in de voorbereidingskit voor de DNA-bibliotheek. Meet de bibliotheekconcentratie en de verdeling van de fragmentgrootte met behulp van elektroforesesystemen met hoge resolutie.

Bundel gelijke hoeveelheden individuele bibliotheken, waaronder de input H3K4me3-chromatine-immunoprecipitatie, BrdU-immunoprecipitatie, eSPAN-monsters om parallelle gepaarde eindsequencing uit te voeren. Een typische gelanalyse van de DNA-sequencingbibliotheek van H3K4me3 eSPAN onthulde een chromatinenucleosoomladderpatroon. De belangrijkste mononucleosoomband verscheen bij 270 basenparen waar de adapters werden toegevoegd aan het DNA-fragment verkregen uit de spijsvertering.

De verschillende monsterkartering onthulde pieken bij individuele nucleosomen rond de oorsprong die autonoom replicerende sequentie 607 repliceert in wildtype en mcm2-3A-cellen. De gemiddelde strengvertekening toonde aan dat in wildtype gistcellen de ouderlijke histonafzetting een lichte vertekening vertoonde in de richting van de achterblijvende streng. In de mutante ouderlijke histon werd H3H4 echter overgebracht naar de leidende streng.