Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

De voorbereiding van cryogene monsters wordt geconfronteerd met uitdagingen die de effectiviteit ervan kunnen beperken, met name een ongelijke deeltjesverdeling. Dit probleem leidt vaak tot een slechte resolutie en verminderde nauwkeurigheid in nieuw geconstrueerde eiwitstructuren. Er worden verschillende experimentele benaderingen gebruikt om een ongelijke deeltjesverdeling te verhelpen, waaronder het toevoegen van detergenten of membraannabootsers aan het monster, het wijzigen van de roostersteunfilm en het kantelen van een specifieke fase tijdens het verzamelen van gegevens.

Dit protocol analyseert een eenvoudige, praktische methode om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door middel van optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt onze referentie voor onderzoekers om macromolecuulstructuren efficiënt te illustreren met behulp van cryogeen. Verzamel om te beginnen de gepoolde eiwitfracties die MJ small heat shock protein 16.5 bevatten. Gebruik centrifugaalfilters met een grenswaarde van 50 kilodalton molecuulgewicht om de fracties bij vier graden Celsius te concentreren tot ongeveer 65 milligram.

Centrifugeer het monster na concentratie gedurende 16.000 minuten bij 10 minuten bij vier graden Celsius om aggregaten te verwijderen. Aliquot 50 microliter volumes van het bovenstaande in dunwandige PCR-buisjes van 0,2 milliliter. Ontdooi voor transmissie-elektronenmicroscopie twee bevroren eiwitbuisjes op ijs.

Eenmaal ontdooid, tik je de tube meerdere keren om te mengen. Centrifugeer vervolgens de eiwitoplossing bij 16.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om aggregaten te verwijderen. Injecteer vervolgens het bovenstaande op een chromatografiekolom voor het uitsluiten van grootte en verzamel elutiefracties van 0,5 milliliter.

Verzamel de eluciaanse fracties die overeenkomen met de piek en vertonen de hoogste ultraviolette absorptie bij 280 nanometer. Knip voor het wisselen van buffers met een schaar een dialysemembraan in stukjes van 30 bij 30 millimeter. Incubeer de stukjes in gedestilleerd water of bufferoplossingen om ze in evenwicht te brengen.

Voeg vervolgens 55 microliter van de eiwitoplossing toe aan een kamer met 50 microliter microdialyseknoppen. Houd het dialysemembraan verticaal met een tang en raak voorzichtig een rand van het membraan aan tegen tissuepapier om overtollige vloeistof af te tappen. Bedek de microdialyseknop voorzichtig met het membraan.

Plaats de O-ring op het dialysemembraan en rol deze voorzichtig in de groef aan de rand van de knop. Dompel elke dialyseknop onder in een afzonderlijk bekerglas met de bestemmingsbuffer met de membraanzijde naar boven. Gebruik een spuit met een fijne naald om het membraan voorzichtig te ponsen en de eiwitoplossing uit de microdialysekamer te halen.

Laad vijf microliter van het monster met een concentratie van 20 tot 120 nanogram per milliliter op een gloeiontladingsrooster. Bereid drie waterdruppels van elk 50 microliter op een vel paraffinefilm. Wrijf het roosteroppervlak tegen de waterdruppels om het monster te wassen.

Laad nu vijf microliter gefilterde 1% urinoiracetaatoplossing op het rooster en pipetteer de urinoiracetaatoplossing onmiddellijk weg. Laad nog eens vijf microliter van de urinoiracetaatoplossing op het rooster. Raak de pincetzijde van het rooster voorzichtig aan met filterpapier om overtollige vlekkenoplossing te verwijderen en laat het rooster drogen.

Monteer het pincet en het gloeiontladingsrooster op het instrument. Laad vervolgens vier microliter van het monster op de koolstofzijde van het rooster. Start het invriesproces voor duiken.

Om de roosters voor te bereiden om op de transmissie-elektronenmicroscoop of TEM te laden, plaatst u eerst een rasterdoos met verglaasde roosters in het auto-grid-assemblagestation en schroeft u het deksel van een rasterdoos met verglaasde roosters los. Plaats de auto-grid-ring in de daarvoor bestemde uitsparing op het montagestation. Verplaats het verglaasde rooster voorzichtig uit de rasterdoos en plaats het in de auto-rasterring.

Lijn nu de schijf uit om de ronde opening bovenop de auto-gridring en roosterconstructie te plaatsen. Om het rooster in de auto-grid-ring te bevestigen, plaatst u het gereedschap voor het inbrengen van de C-clip bovenop het raster en drukt u voorzichtig naar beneden om de C-clip erin vast te zetten. Draai de schijf terug en verplaats de gemonteerde roosters naar de opbergdoos voor automatische rasters.

Zet het cassettelaadstation in elkaar en koel het af met vloeibare stikstof. Plaats de auto-grid opbergbox in het laadstation. Verplaats het rooster van de opbergdoos voor het auto-raster naar de cassette.

Gebruik het handvat om de cassette in de auto-loader-capsule te plaatsen. Controleer de pin in de autoloader om te bevestigen dat deze vrij kan bewegen en zorg ervoor dat deze niet vastloopt. Deeltjesaccumulatie in arrays werd waargenomen op alle geteste roosters, ongeacht de bufferomstandigheden of wijzigingen in de oppervlaktelading.

Een hogere eiwitconcentratie in combinatie met negatief geladen roosters in negen millimolair van mobstress, 50 millimolair natriumchloride en 0,1 millimolair EDTA-buffer resulteerde in de gewenste verdeling van afzonderlijke deeltjes in roostergaten, waardoor de vorming van eiwitarrays werd verminderd. Deze geoptimaliseerde toestand leidde tot een hoge conische FSC-oppervlakteverhouding van 0,80 en een SCF-waarde van 0,859, wat een uniforme deeltjesverdeling bevestigt.