Name: Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie zonder papierblotting. Deze methode minimaliseert sampleverlies en maakt analyse van enkele cellen voor visuele proteomics mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank de workshop van de Biozentrum van de Universiteit van Bazel voor hun steun, S. A. Müller voor kritische discussies en zorgvuldig lezen van het manuscript, A. Fecteau-LeFebvre voor technische bijstand met EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann voor membraan eiwit testen monsters (alle uit de C-CINA, de Biozentrum, de Universiteit van Bazel) en A. Engel, emeritus Universiteit Bazel voor zijn inspirerende gesprekken. Monsters werden beschikbaar gesteld door P. Ringler, M.-A. Mahi, en T. Schwede (Biozentrum, Universiteit van Bazel), P. Leiman (laboratorium van structurele biologie en biofysica, EPFL) en R. Diaz-Avalos (structurele biologie Center, USA New York). Het project werd ondersteund door het Zwitserse Nanoscience Instituut (DNI, project P1401, ARGOVIA project MiPIS) en de Zwitserse National Science Foundation (SNF, project 200021_162521).

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

De auteurs Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg en Thomas Braun verklaren de volgende concurrerende financiële belangen: het cryoWriter-concept is onderdeel van de aanvrage om octrooi PCT / EP2015/065398 en EP16194230.

De 'cryoWriter'-instrument en de protocollen die zijn vereist voor het bereiden van monster rasters voor NS - en cryo-EM van nL grootte totale steekproef volumes en helemaal vermijden de klassieke papier-bevlekken stap worden gepresenteerd. Microfluidic beginselen en een micromechanische systeem zijn gecombineerd in de cryoWriter dit mogelijk te maken.
Onze ervaring leert dat wanneer de verkleinde methoden gepresenteerd in dit manuscript worden gebruikt, de parameter ruimte voor de voorbereiding van de EM-raster groter dan voor de klassieke methoden, en onder strengere controle van de gebruiker is. Nog belangrijker is, maakt de verhoogde reproduceerbaarheid bereikt het mogelijk om vooraf te controleren met monster buffersysteem, aangevuld met een eiwit beschikbaar test, om te bepalen van de optimale parameters voordat het werkelijke experiment is uitgevoerd. Dit houdt van consumptie van het monster van belang tot een absoluut minimum en wordt sterk aangeraden. Kritische stappen voor de voorbereiding van beide NS - en cryo-EM raster zijn: (i) Priming van de pompsysteem; met betrekking tot sub-nanoliter volume aflevering, moet het systeem vloeistof (water) worden ontgaste en gratis bubble. (ii) nauwkeurige controle van de gloed lozing of plasma schoonmaken stap; de oppervlakte kenmerken van het EM-raster zijn cruciaal voor reproduceerbare resultaten. (iii) monster conditionering; de tijd die nodig is voor het conditioneren, bijvoorbeeldmet de NS, hangt af van de aard van de buffer, de zoutgehalte en de concentratie (Figuur 3), en op de geometrie van het mondstuk van de microcapillary24. (iv) de verdampingssnelheden voor NS-EM preparaten voor kwantitatieve EM; de koffie-ring effect kan verbieden de kwantitatieve analyse van NS-EM preparaten, en moet worden onderdrukt door langzame verdampingssnelheden gecontroleerd door de DP-fase.
Verschillende aspecten van de gepresenteerde raster bereidingswijzen kunnen vrij worden gecombineerd waardoor de ontwikkeling van veelzijdige protocollen voor specifieke monsters. Typische voorbeelden zou de schrapping van een stof die hoge resolutie EM, bijvoorbeeld, glycerol, door een conditionering stap vóór raster voorbereiding voor cryo-EM voorkomt; de invoering van bemiddelaar moleculen, zoals liganden, door conditionering voordat de rasters worden bereid; of het onderzoek van eencellige lysate door NS - of cryo-EM (Figuur 6).
Het gebruik van microfluidics en minimal steekproef bedragen in de gepresenteerde methoden elimineert volledig de noodzaak voor papier-bevlekken stappen. Dit is een groot voordeel, want papier bevlekken een harde behandeling voor eiwitten is, potentieel verontreiniging van de steekproef met ongewenste ionen en inherent leidt tot massale monster verlies. Aan de andere kant, effecten, mogelijk veroorzaakt door de lucht-water-interface van de dunne monster film gevormd wanneer cryo-EM monsters zijn voorbereid op de klassieke manier niet vermeden wanneer de cryoWriter wordt gebruikt. Rasters geschikt voor cryo-EM kunnen bereid worden met een wachttijd van minder dan 0,2 s tussen voorbeeldtoepassing en verglazing (gegevens niet worden weergegeven). Als een paar tienden van een nanometer in een paar nanoseconden eiwitten door diffusie reizen, is er echter nog steeds genoeg tijd voor hen te botsen met de interface van de lucht-water van een 100 nm dikke monster film meerdere malen. Echter, de hoeveelheid eiwitten die vasthouden aan de lucht-water-interface kan aanzienlijk worden verkleind door deze korte tijd leemten en ertoe leiden dat denaturatie van eiwit of particle oriëntatie beperkt. Een andere veelbelovende aanpak die gevoelige eiwitten voor de lucht-water-interface behoeden kan is ter dekking van de film monster door laag molecuulgewicht tensioactieve stoffen. Deze verbindingen kunnen snel worden ingevoerd door een stap van de conditionering in de cryoWriter voor de bereiding van het raster. De hoge verhouding van oppervlakte-naar-volume van microfluidic systemen is een verdere beperking van de cryoWriter, zoals monster potentieel kan worden verloren door aspecifieke adsorptie aan de oppervlakte van de microcapillary en verstoren van kwantitatieve analyse door het tellen van deeltjes. Het probleem is gericht op twee manieren: ten eerste, het monster doet niet reizen lange afstanden binnen de microcapillary. Inderdaad, het monstervolume nanoliter blijft op de capillaire tip tijdens de verwerking. Ten tweede: de oppervlakte volumeverhouding is verder verminderd door het gebruik van microcapillaries met relatief grote innerlijke diameters, b.v., 180 µm. ten derde, de oppervlakken van de microcapillaries kunnen gemakkelijk worden gepassiveerd, indien nodig, bijvoorbeelddoor ze te behandelen met verkrijgbare polylysine ethanol glycolen (PLL-PEG).
De hoge resolutie analyse van eiwitten door de aanpak van één deeltje gebruikt in EM vereist slechts 100.000 tot een paar miljoen beelden van individuele eiwit deeltjes. Dit betekent dat microfluidic technieken genoeg eiwitcomplexen voor de structurele onderzoek bieden kunnen. Een verkleinde immuno-neerslag-methode voor de snelle isolatie van eiwitcomplexen (ongeveer 1 uur) van minimal cel bedragen (ca. 40.000 cellen) werd eerder28ontwikkeld. Deze methode zal nu direct worden gekoppeld aan de fase van de bereiding van het verkleinde monster van de cryoWriter. Het uiteindelijke doel is het ontwikkelen van een pijpleiding van de geïntegreerde microfluidic voor ultrasnelle eiwit isolatie en cryo-EM raster voorbereiding, waarvoor minder dan twee uur in alle. Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 6, het minieme bedrag en de hoeveelheid materiaal dat nodig is voor de bereiding van de monsters en de bijna lossless airconditioning en raster voorbereiding procedure bereikt met behulp van de cryoWriter, het mogelijk maken te bestuderen van het eiwit complexen van afzonderlijke cellen. Samen de verkleinde immuno-neerslag-methode en de cryoWriter de basis leggen voor een nieuwe proteomics methode genaamd "eencellige visuele proteomics", zoals we onlangs aangetoond voor warmte-schok experimenten24. Data analyse algoritmen gericht op de analyse van "visuele proteomics" beelden worden momenteel getest.

Hardware en software voor de structurele analyse van eiwitcomplexen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) heeft massaal op vooruit gegaan gedurende de afgelopen jaren. De verbeteringen die zijn aangebracht aan een "resolutie revolutie"1,2 geëffend en fundamenteel veranderd structurele onderzoek. De revolutie begon met de komst van cryo-Elektron microscopie (cryo-EM)3,4, zodat de voorbereiding van biologische monsters onder dichtbij fysiologische omstandigheden terwijl het verminderen van de gevoeligheid van de straling en het voorkomen van de verdamping van het monster in de hoog vacuüm van de transmissie elektronenmicroscoop5. In de daaropvolgende jaren verhoogde incrementele technologische vooruitgang geleidelijk de resolutie haalbaar. Onder deze innovaties waren de toepassing van veld-emissie kanonnen6,7, en, meer recentelijk, verbeterd data analyse algoritmen, zoals maximale waarschijnlijkheid methoden8,9. Directe elektron detector camera's10,11,12,13, filmwijze beeldvorming en de bijbehorende software ontwikkelingen14,15, 16 , 17, verstrekt de definitieve doorbraak verplicht te bereiken van atomaire resolutie voor biologische monsters door één deeltje analyse (Zie voor een overzicht Cheng, Grigorieff, et al.. 18). het belang van cryo-EM werd onlangs erkend door de toekenning van de Nobelprijs voor de Scheikunde tot drie van de Pioniers.
Naar een biologische steekproef door TEM image, de methode gebruikt voor het laden van het EM-raster met monster (hierna "raster voorbereiding" genoemd) moet ervoor zorgen dat de resulterende monster laag (i) dun genoeg (< 100 nm) te vermijden veelomvattend rumoer door inelastisch of vermenigvuldigen verspreid elektronen, (ii) het hoog vacuüm van de elektronenmicroscoop doorstaat, en (iii) de biomoleculen beschermt tegen schade door straling. Twee belangrijkste methoden worden gebruikt om te voldoen aan deze voordelen: negatieve vlek(NS)19,20 procedures (Figuur 1A) adsorberen van het monster, tot een dunne koolstof-film, de biomoleculen insluiten in amorfe heavy metal en vervolgens toestaan dat de vergadering te drogen in de lucht. Dit is eenvoudig en snel, en de geladen EM rasters (hierna "monster rasters" genoemd) zijn gemakkelijk te slaan en kan worden gehouden voor langere tijd (meestal jaren). In TEM, de voorbereidingen vertonen hoog contrast als gevolg van de NS en tolereren van hogere doseringen van de elektron dan cryo-voorbereiding, maar de resolutie is beperkt tot ongeveer 20 Å. Cryo-EM procedures (Figuur 1B) dienst een koolstof ondersteunt. Een dunne film van de monsteroplossing is spanned over de gaten en het EM-raster is ondergedompeld in een cryogen, meestal vloeibaar ethaan, te snel afkoelen onder-150 ° C. Het resultaat is een amorf, verglaasd, 50 tot 100 nm-dikke film van de oplossing in de gaten van de steun. Deze dunne, amorf film doorstaat de hoog vacuüm in de elektronenmicroscoop en, in het ideale geval behoudt biologische structuren in hun oorspronkelijke staat. De procedure kan biologische monsters aan het image worden gemaakt op hoge resolutie. Echter moet het raster van steekproef worden bewaard bij temperaturen hieronder-150 ° C te allen tijde te vermijden ontglazing. Image kan worden gemaakt met behulp van relatief hoge elektron doses als gevolg van de lage temperatuur, maar het contrast en signaal-/ ruisverhouding is toch laag. Dus gemiddeld technieken zijn gebruikt om het contrast te verhogen en, mits de steekproef is beeld vanuit verschillende hoeken, een high-resolution driedimensionale (3D)-kaart kan worden gereconstrueerd. De meest gebruikte en zeer succesvolle methode voor 3D reconstructie vanaf nu is de aanpak van één deeltje. Zie voor een recente review, Cheng op al.18.
Negatieve vlek TEM (NS-EM) is belangrijk voor screening en kwaliteitscontrole, wanneer hoog contrast vereist is of wanneer er slechts een beperkte hoeveelheid monster beschikbaar zijn (adsorptie aan de koolstof-film over het algemeen richt zich het monster). Één deeltje cryo-EM is de gouden standaard methode als high-resolution 3D-reconstructies van de eiwitstructuur voor zijn gericht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Figuur 1: beginselen van TEM raster voorbereiding en vergelijking tussen het klassieke (deelvenster A, B) en een microfluidic benadering (deelvenster C, D). A) klassieke NS-EM raster voorbereiding: over 3 µL van monster zijn afgepipetteerde met de hand op een raster van de EM bedekt met een film van de continue koolstof (hierna een "NS-EM raster' genoemd) (i). Na incubatie gedurende ca. 10 s, filterpapier wordt gebruikt om de vlek weg de overtollige vloeistof uit de kant (ii), waardoor de geadsorbeerde biomoleculen in een dunne water-film. Het eiwit is vervolgens geïncubeerd in een zoutoplossing van heavy metal, bijvoorbeeld, 2% uranyl acetaat, voor 20 s (iii), en opnieuw de vloeistof wordt verwijderd door het bevlekken van de kant met behulp van filtreerpapier (iv). Tot slot wordt het EM-raster overgelaten aan het drogen in de lucht. B) klassieke cryo-EM raster voorbereiding: afgepipetteerde over 3 µL van monster zijn door een hand op een film van een koolstof. Vormen een dunne monster film, wordt de overtollige vloeistof verwijderd door papier-bevlekken gezicht-op uit één of beide zijden (ii). Tot slot is het raster snel ondergedompeld in vloeibare ethaan voor verglazing (iii). C) NS-EM raster voorbereiding met behulp van het cryoWriter-setup: A 5 nL volume is aanzuiging uit de voorraad van de monster met behulp van een microcapillary (i). De microcapillary tip is voor monster conditioning, ondergedompeld in de conditionering oplossing, bijvoorbeeld2% ammoniumacetaat. Ionen en kleine moleculen worden uitgewisseld door diffusie (ii). Merk op dat de afmetingen van de microcapillary ervoor zorgen dat het hele proces diffusie gedreven. Eiwitten hebben veel lagere diffusie-constanten zijn dan zout ionen en24niet aanzienlijk verloren. Tot slot is het monster afgeleverd op de grid en toegestaan om te drogen (iii). D) beginselen van cryo-EM raster preparaat met behulp van de cryoWriter gebaseerde methode: An EM raster bedekt met een film van een koolstof is geplaatst op het oppervlak van een temperatuurgevoelig platform en gehouden door pincet. De temperatuur van het platform wordt beheerd op een offset van de dauwpunt temperatuur van de omgeving van het raster. Het raster wordt verplaatst ten opzichte van de microcapillary met het monster en de microcapillary wordt verlaagd totdat het enkele micrometers boven het raster. Vervolgens zijn een paar nanoliters van monster afgezien van het terwijl de fase wordt verplaatst in een spiraalpatroon; overtollige vocht is opnieuw aanzuiging (i). Na EM raster priming, de microcapillary is ingetrokken en het raster blijft op de temperatuur gecontroleerde platform (hierna genoemd als dauwpunt (DP) fase) voor een korte tijd om een gecontroleerde hoeveelheid monster te verdampen. Voor duik bevriezing, is het raster snel teruggetrokken uit het werkgebied met het pincet (ii), bladerde door 90° in de verticale positie, en ondergedompeld in een bad met cryogen (iii) (hierna 'pick-en-wagen' mechanisme genoemd). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Helaas, het raster voorbereiding methoden voor NS en cryo-EM hebben niet aanzienlijk verbeterd sinds ze werden uitgevonden. Huidige nadelen zijn de hoge monster consumptie (ca. 3 µL van het eiwit van 1 mg/mL) en de grote hoeveelheid (> 99%) monster verloren (Figuur 1A, B). Bovendien, de klassieke methode gebruikt voor te bereiden op rasters cryo-EM is een strenge procedure voor eiwitten: ten eerste, het gaat om een uitgebreide gezicht-op papier-bevlekken stap (Figuur 1B, ii), en ten tweede, het eiwit wordt blootgesteld aan de lucht-water-interface voor een aanzienlijke hoeveelheid tijd21. Hier, een alternatieve methode voor het monster preconditionering, Raster monstervoorbereiding en post-processing (raster drogen of verglazing) voor NS-EM (Figuur 1C) of cryo-EM (Figuur 1D) wordt gepresenteerd. De in-house gebouwde setup, genaamd "cryoWriter", gebruikt verkleinde monster hanteren beginselen van technologie- en microfluidic gecombineerd, voorwaarde en afzien van monster, vermijden papier volledig bevlekken en het bieden van alternatieve methoden voor dunne monsters voor Cryo-EM. Het aanzienlijk vermindert monster consumptie en verbetert gebruiker-controle over de bereiding van de monsters als geheel. Bovendien, de methode maakt het mogelijk nieuwe experimentele toepassingen; zoals de voorbereiding van geïsoleerde biologische componenten van afzonderlijke cellen in een aanpak genaamd "eencellige visuele proteomics"22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Vloeistofverwerking</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary tip</td><td>New Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro;m tip ID, 100 &micro;m ID, pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro;m tip ID, 150 &micro;m ID, pk. 20</td></tr><tr><td>Geleidende hoes</td><td>New Objective</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Geleidende elastomer voor HV-contact, 12" lang</td></tr><tr><td>Glasbuis met gesmolten silica</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standard FS Tubing, 150 &micro;m ID, 363 &micro;m OD, 5 meter</td></tr><tr><td>PressFit-connector</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit Connector 0,25 naar 0,25 mm ID, pk. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuit 10 &micro;l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (naald niet inbegrepen)&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuitpompcontroller</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS-controller</td></tr><tr><td>Spuitpompdoseerunit</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS-doseerunit</td></tr><tr><td>Temperatuurregeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dauwpuntsensor</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Vocht/temperatuursensor, dauwpuntberekening, USB en ingebedde DLL</td></tr><tr><td>Temperatuursensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Op het oppervlak monteerbare temperatuursensor Pt1000</td></tr><tr><td>Peltier-controller</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>PID-temperatuurregelaar voor activering van door Peltier aangedreven systemen met constante spanningsuitgang</td></tr><tr><td>Peltier-element</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Waterkoelblok</td><td>-</td><td>-</td><td>Waterkoelblok voor 40x40 mm peltier-element, koperen basis</td></tr><tr><td>Waterpomp</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td></tr><tr><td>Waterwarmtewisselaarblok</td><td>-</td><td>-</td><td>Waterwarmtewisselaarblok met 2 ventilatoren om circulerend water af te koelen</td></tr><tr><td>Kleine waterkoelers</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram koper editie 2 stuks</td></tr><tr><td>Kleine peltier-elementen</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &deg;C, 2 stuks</td></tr><tr><td>Mechaniek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lineaire trap z-as</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Precisievertalentrap met hoge belasting, 50 mm reisbereik, DC-motor</td></tr><tr><td>Trapcontroller</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Microscoop xy-astrap</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Gemotoriseerde trap voor Zeiss Axiovert 200 omgekeerde microscoop</td></tr><tr><td>Kleine permanente magneten</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Staafmagneet &Oslash; 5 mm, hoogte 8,47 mm, neodymium, N45, vernikkeld, pk. 10</td></tr><tr><td>Kleine elektromagneet</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Elektromagneet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Elektromagneetcontroller</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Elektromagneetbesturing PCB-bord</td></tr><tr><td>Solenoïdehub</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini-pincet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, superdunne punten</td></tr><tr><td>Verschillende optomechanische onderdelen</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Verschillende mechanische onderdelen</td><td>Workshop Biozentrum, University Basel</td><td>-</td><td>Op maat ontworpen adapterplaten, houders, enz. zie bijgevoegde CAD-bestanden</td></tr><tr><td>Optische</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserdiode</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm laserdiodemodule 2,5 mW</td></tr><tr><td>Fotodetector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM-rasters</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td>emsdiasum.com</td><td>DTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; siliciumnitridemembranen voor TEM, pakket van 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. kleuring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp;SIGMA</td><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negatieve kleuring op basis van vanadium</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negatieve kleuring op basis van wolfraam</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>Het openBEB 2-framework is beschikbaar op aanvraag, versie 3 is downloadbaar</td></tr><tr><td>CryoWriter-besturingssoftware (openBEB-plug-in)</td><td></td><td>Beschikbaar op aanvraag, extra kosten voor driver-software van derden kunnen van toepassing zijn.</td><td></td></tr></tbody></table>

verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Als gevolg van de recente technologische vooruitgang, wordt cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) snel steeds een standaardmethode voor de structurele analyse van eiwitcomplexen atomaire resolutie. Eiwit isolatie technieken en monster bereidingswijzen voor EM blijven echter een knelpunt. Een relatief klein aantal (100.000 tot een paar miljoen) individuele eiwit deeltjes moet worden beeld voor de hoge-resolutie analyse van eiwitten door het één deeltje EM aanpak, waardoor verkleinde monster behandeling technieken en beginselen van de microfluidic haalbaar.
Een verkleinde, bevlekken-papierloze EM raster voorbereiding methode voor monster pre-conditionering, EM raster priming en nabewerking die alleen nanoliter volumes van monster verbruikt wordt gepresenteerd. De methode maakt gebruik van een doseersysteem met een sub-nanoliter precisie van vloeibare opname van de controle en EM raster priming, een platform waarmee de temperatuur van de raster waardoor het bepalen van de relatieve vochtigheid boven het EM-raster en een pick-en-duik-mechanisme voor het monster verglazing. Voor cryo-EM, een raster van EM in het werkgebied temperatuurgevoelig is geplaatst en het monster wordt in een capillair aanzuiging. De capillaire tip is geplaatst in de nabijheid van het oppervlak van het raster en het raster is geladen met het monster overmaat is opnieuw opgezogen in de microcapillary. Vervolgens is het monster film gestabiliseerd en lichtjes dunner door verdamping van de gecontroleerde water geregeld door de verschuiving van de platform-temperatuur ten opzichte van het dauwpunt. Op een gegeven moment wordt het mechanisme van de pick-en-duik geactiveerd, snel overbrengen van de primer EM raster naar vloeibaar ethaan voor monster verglazing. Als alternatief, monster-conditioning methoden zijn beschikbaar voor te bereiden op monster nanoliter middelgrote volumes negatieve vlek (NS) EM.
De methoden sterk monster verbruik te verminderen en voorkomen van benaderingen van potentieel schadelijke eiwitten, zoals het filtreerpapier bevlekken gebruikt in de conventionele methoden. Voorts staat de minuscule hoeveelheid monster nodig nieuwe experimentele strategieën, zoals snelle monster conditioning, combinatie met eencellige lysis voor "visuele proteomics", of "lossless" voorbereiding van de totale steekproef voor kwantitatieve analyse van complexe monsters.

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de structuurbiologie, zoals de bereiding van gevoelige eiwitten, waarbij een beperkte hoeveelheid eiwit beschikbaar is. Het grote voordeel van deze techniek is dat in vergelijking met standaardmonstervoorbereidingsmethoden slechts minimale hoeveelheden monster nodig zijn en dat er geen ruwe papierblottedap is vereist. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de analyse van enkele cellen door visuele proteomics, of de diagnose van eiwitgerelateerde ziekten.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de technologie beschikbaar hadden om structuren met hoge resolutie op te lossen met slechts ongeveer 100.000 individuele deeltjes. Om te beginnen, bereidt u het monster voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Monteer vervolgens de ethaancup, cryo box houder en spin. En vul de cryogendverzamelbak tot aan de bovenkant met vloeibare stikstof. Na een paar minuten zal de cup koel en vrij van vloeibare stikstof zijn. Open vervolgens de ethaan gasfles en laat het gas langzaam de ethaancup instromen.Laat de cup zich vullen met vloeibaar ethaan totdat het niveau twee tot drie millimeter onder de bovenkant is. Dit duurt enkele minuten en vereist ongeveer vijf milliliter vloeibaar ethaan. Verwijder de spin, plaats het polystyreen deksel erop en plaats de cryogendverzamelbak op de montage in de cryo writer.Pak de glow discharged EM grid met de cryo writer pincetten, knop de pincetten op de elektromagneet en draai de micromanipulator om de grid vlak op het podium te plaatsen, koolstoffilm zijde omhoog. Klik in de software dubbel op grid_save. Pas vervolgens de microcapillair positie aan, zodat de punt ongeveer 10 micrometer boven het gridoppervlak is.Zorg ervoor dat de microcapillair vrij over het grid kan bewegen, zonder het ergens aan te raken. En trek indien nodig de microcapillair een paar micrometer terug. Breng het vervolgens terug naar het centrum van het grid en sla de nieuwe positie op als grid.Verplaats de microcapillair terug naar de startpositie. Spoel vervolgens de microcapillair met een paar tientallen nanoliters systeem vloeistof en gebruik lintvrij tissue om eventuele druppels van de microcapillair te verwijderen. Nu alles is voorbereid, start u het macroscript.De macro beweegt eerst in positie en doseert vijf nanoliters systeem vloeistof om eventuele luchtbellen bij de punt te verwijderen, en gaat vervolgens naar de monsterpositie. Vervolgens zuigt het 65 nanoliters monster aan en doseert vervolgens vijf nanoliters terug in de monstersbuis. Dit houdt rekening met de achteruitgang van het systeem en maakt gesynchroniseerd schrijven mogelijk.Nadat het naar de gridpositie is verplaatst, start het een schrijfpatronen, waardoor de microcapillair over het grid beweegt en gelijktijdig 45 nanoliters monster doseert. Vervolgens brengt het de microcapillair terug naar het centrum van het grid, verlaagt deze nogmaals 10 micrometer en trekt overtollig monsterstof terug. Ten slotte trekt het macro de microcapillair terug en zet de elektromagneet uit, wat het duikvriesmechanisme initieert.Eenmaal losgemaakt van de magneet, laat u de magnetische adapter voorzichtig los van de zuiger en brengt u het raster snel over van de ethaancup naar de cryogendverzamelbak, die de cryobox bevat, en plaatst u het raster in een vrije sleuf. Om te beginnen, bereidt u cellen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol en monteert u de indium tin oxide slide op de microscoopinzet. Gebruik twee schroeven om de slide op de aluminiuminzet te bevestigen en om elektrische contacten te garanderen tussen de indium tin oxide coating van de slide en het geaardde aluminium frame.Verwijder vervolgens het cellenkweekmedium uit de put en was de cellen tweemaal met 300 microliters elektroporatiebuffer. Na de laatste wassing, houdt u de cellen in de elektroporatiebuffer. Plaats vervolgens de aluminiuminzet met de indium tin oxide slide in de live cell incubator stage, op de set-up.Gebruik de microscoop om de cellenkweek te lokaliseren en kies een gebied zonder cellen. Breng de punt van de microcapillair op het oppervlak van de slide en raak deze voorzichtig aan. Trek vervolgens de punt terug in 100 micrometer en sla de positie op als cellen.Verlaat nu snel de cellenkweek en spoel de punt van de microcapillair met een paar tientallen nanoliters systeem vloeistof, plaats deze vervolgens weer in de cellenkweek. Doseer een paar nanoliters tijdens de onderdompeling in de PDMS put om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen op de punt zitten. Dubbelklik op de positie van de cel en benader voorzichtig het oppervlak van de indium tin oxide slide en trek bij contact de punt 10 micrometer terug.Selecteer op dit punt een nabijgelegen cel voor lysis. en plaats de punt van de microcapillair boven de doelcel. Start vervolgens het macroscript voor single-cel lysis.Eenmaal gestart, zal het script vragen naar een positie waarnaar de microcapillair moet worden verplaatst nadat een cel succesvol is gelyseerd. Voer de gewenste positie in, bijvoorbeeld grid, voor de EM grid. Het macro zal vervolgens doorgaan zonder tussenkomst van de gebruiker en zal beginnen door het podium van de microscoop 100 micrometer naar links te verplaatsen, waar het een momentopname van de doelcel maakt.Vervolgens doseert 15 nanoliters dubbel gedestilleerd water uit de microcapillairbuis, verplaatst en verdunt het buffer met hoge zoutconcentratie, en past osmotische druk toe op de cel. Vervolgens beweegt het podium terug om de punt weer boven de doelcel te positioneren. Daar wordt een voorgedefinieerde spanningsstoot toegepast en na 500 milliseconden begint het pompsysteem drie nanoliters monster te aspireren met een stroomsnelheid van twee microliter per minuut.Ten slotte beweegt het podium weer naar links, waardoor de cel kan worden geïnspecteerd. Er verschijnt een venster dat om gebruikersinvoer vraagt. Als de cel succesvol was, voer ja in om een momentopname van de geliseerde cel te maken.Daarna verplaatst de microcapillair zich naar de endo-locatie, ondergedompeld

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Hier presenteren we een protocol om monsters met een laag aantal cellen voor te bereiden op transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Dit rapport beschrijft een monstervoorbereidingsprotocol en specifieke beeldvormingscondities voor het uitvoeren van schuifende transmissie-elektronentomografie van dikke biologische monsters.

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

Deze studie geeft betrouwbare en eenvoudige procedures voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van een micro-organisme zonder dure apparatuur in transmissie-elektronenmicroscopie.

Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .

Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

Leer een verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie zonder papierblotting. Deze methode minimaliseert sampleverlies en maakt analyse van enkele cellen voor visuele proteomics mogelijk.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen