Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie
July 27th, 2018
Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de structuurbiologie, zoals de bereiding van gevoelige eiwitten, waarbij een beperkte hoeveelheid eiwit beschikbaar is. Het grote voordeel van deze techniek is dat in vergelijking met standaardmonstervoorbereidingsmethoden slechts minimale hoeveelheden monster nodig zijn en dat er geen ruwe papierblottedap is vereist. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de analyse van enkele cellen door visuele proteomics, of de diagnose van eiwitgerelateerde ziekten.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de technologie beschikbaar hadden om structuren met hoge resolutie op te lossen met slechts ongeveer 100.000 individuele deeltjes. Om te beginnen, bereidt u het monster voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Monteer vervolgens de ethaancup, cryo box houder en spin.
En vul de cryogendverzamelbak tot aan de bovenkant met vloeibare stikstof. Na een paar minuten zal de cup koel en vrij van vloeibare stikstof zijn. Open vervolgens de ethaan gasfles en laat het gas langzaam de ethaancup instromen.
Laat de cup zich vullen met vloeibaar ethaan totdat het niveau twee tot drie millimeter onder de bovenkant is. Dit duurt enkele minuten en vereist ongeveer vijf milliliter vloeibaar ethaan. Verwijder de spin, plaats het polystyreen deksel erop en plaats de cryogendverzamelbak op de montage in de cryo writer.
Pak de glow discharged EM grid met de cryo writer pincetten, knop de pincetten op de elektromagneet en draai de micromanipulator om de grid vlak op het podium te plaatsen, koolstoffilm zijde omhoog. Klik in de software dubbel op grid_save. Pas vervolgens de microcapillair positie aan, zodat de punt ongeveer 10 micrometer boven het gridoppervlak is.
Zorg ervoor dat de microcapillair vrij over het grid kan bewegen, zonder het ergens aan te raken. En trek indien nodig de microcapillair een paar micrometer terug. Breng het vervolgens terug naar het centrum van het grid en sla de nieuwe positie op als grid.
Verplaats de microcapillair terug naar de startpositie. Spoel vervolgens de microcapillair met een paar tientallen nanoliters systeem vloeistof en gebruik lintvrij tissue om eventuele druppels van de microcapillair te verwijderen. Nu alles is voorbereid, start u het macroscript.
De macro beweegt eerst in positie en doseert vijf nanoliters systeem vloeistof om eventuele luchtbellen bij de punt te verwijderen, en gaat vervolgens naar de monsterpositie. Vervolgens zuigt het 65 nanoliters monster aan en doseert vervolgens vijf nanoliters terug in de monstersbuis. Dit houdt rekening met de achteruitgang van het systeem en maakt gesynchroniseerd schrijven mogelijk.
Nadat het naar de gridpositie is verplaatst, start het een schrijfpatronen, waardoor de microcapillair over het grid beweegt en gelijktijdig 45 nanoliters monster doseert. Vervolgens brengt het de microcapillair terug naar het centrum van het grid, verlaagt deze nogmaals 10 micrometer en trekt overtollig monsterstof terug. Ten slotte trekt het macro de microcapillair terug en zet de elektromagneet uit, wat het duikvriesmechanisme initieert.
Eenmaal losgemaakt van de magneet, laat u de magnetische adapter voorzichtig los van de zuiger en brengt u het raster snel over van de ethaancup naar de cryogendverzamelbak, die de cryobox bevat, en plaatst u het raster in een vrije sleuf. Om te beginnen, bereidt u cellen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol en monteert u de indium tin oxide slide op de microscoopinzet. Gebruik twee schroeven om de slide op de aluminiuminzet te bevestigen en om elektrische contacten te garanderen tussen de indium tin oxide coating van de slide en het geaardde aluminium frame.
Verwijder vervolgens het cellenkweekmedium uit de put en was de cellen tweemaal met 300 microliters elektroporatiebuffer. Na de laatste wassing, houdt u de cellen in de elektroporatiebuffer. Plaats vervolgens de aluminiuminzet met de indium tin oxide slide in de live cell incubator stage, op de set-up.
Gebruik de microscoop om de cellenkweek te lokaliseren en kies een gebied zonder cellen. Breng de punt van de microcapillair op het oppervlak van de slide en raak deze voorzichtig aan. Trek vervolgens de punt terug in 100 micrometer en sla de positie op als cellen.
Verlaat nu snel de cellenkweek en spoel de punt van de microcapillair met een paar tientallen nanoliters systeem vloeistof, plaats deze vervolgens weer in de cellenkweek. Doseer een paar nanoliters tijdens de onderdompeling in de PDMS put om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen op de punt zitten. Dubbelklik op de positie van de cel en benader voorzichtig het oppervlak van de indium tin oxide slide en trek bij contact de punt 10 micrometer terug.
Selecteer op dit punt een nabijgelegen cel voor lysis. en plaats de punt van de microcapillair boven de doelcel. Start vervolgens het macroscript voor single-cel lysis.
Eenmaal gestart, zal het script vragen naar een positie waarnaar de microcapillair moet worden verplaatst nadat een cel succesvol is gelyseerd. Voer de gewenste positie in, bijvoorbeeld grid, voor de EM grid. Het macro zal vervolgens doorgaan zonder tussenkomst van de gebruiker en zal beginnen door het podium van de microscoop 100 micrometer naar links te verplaatsen, waar het een momentopname van de doelcel maakt.
Vervolgens doseert 15 nanoliters dubbel gedestilleerd water uit de microcapillairbuis, verplaatst en verdunt het buffer met hoge zoutconcentratie, en past osmotische druk toe op de cel. Vervolgens beweegt het podium terug om de punt weer boven de doelcel te positioneren. Daar wordt een voorgedefinieerde spanningsstoot toegepast en na 500 milliseconden begint het pompsysteem drie nanoliters monster te aspireren met een stroomsnelheid van twee microliter per minuut.
Ten slotte beweegt het podium weer naar links, waardoor de cel kan worden geïnspecteerd. Er verschijnt een venster dat om gebruikersinvoer vraagt. Als de cel succesvol was, voer ja in om een momentopname van de geliseerde cel te maken.
Daarna verplaatst de microcapillair zich naar de endo-locatie, ondergedompeld
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor het bereiden van nanoliter-grootte monstervolumes voor transmissie-elektronenmicroscopie zonder de noodzaak van papier-blotting stappen. Deze techniek vermindert aanzienlijk het monsterverlies en maakt de analyse van single cel lysaten mogelijk voor visuele proteomics.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structurele Biologie
- Proteomics
- Single Cel Analyse
Achtergrond
- Traditionele monstervoorbereidingsmethoden vereisen vaak grote hoeveelheden monster.
- Papier blotting kan gevoelige eiwitten nadelig beïnvloeden.
- Deze methode maakt de analyse van beperkte eiwit hoeveelheden mogelijk.
- Hoge resolutie structuren kunnen worden opgelost met minimale monsterhoeveelheid.
Doel van de studie
- Om een techniek te ontwikkelen die het monsterverlies tijdens de voorbereiding minimaliseert.
- Om de analyse van single cel lysaten te vergemakkelijken.
- Om de diagnose van eiwit-gerelateerde ziekten te verbeteren door visuele proteomics.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van monsters in een cryogeen container.
- Gebruik van een microcapillair voor nauwkeurige monsteruitgifte.
- Implementatie van een macro script voor geautomatiseerde monsterbehandeling.
- Toepassing van osmotische druk voor cel lysis.
Belangrijkste resultaten
- De methode bereidt met succes nanoliter volumes zonder monsterverlies voor.
- Single cel lysaten kunnen effectief worden geanalyseerd.
- Hoge resolutie beeldvorming van eiwitten is haalbaar.
- De techniek toont belofte voor het diagnosticeren van eiwit-gerelateerde ziekten.
Conclusies
- Deze innovatieve methode verbetert de studie van gevoelige eiwitten.
- Het opent nieuwe mogelijkheden voor single cel analyse in proteomics.
- De afwezigheid van papier blotting verbetert de monster integriteit.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in structural biology by enabling high-resolution protein analysis from nanoliter sample volumes, directly supporting target validation when protein availability is limited. By eliminating paper blotting and reducing sample loss, it enhances sample integrity and reproducibility—key factors for reliable assay development and mechanistic de-risking in early discovery. The capability to integrate with single-cell lysis opens pathways for visual proteomics, expanding the utility of cryo-EM in phenotypic screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of low-abundance or sensitive protein targets that are difficult to isolate in sufficient quantities using conventional methods.
- Operational Value: Reduces sample consumption from microgram to nanogram scales, conserving precious material for downstream assays and minimizing waste in precious target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports confident target de-risking by providing high-fidelity structural data from minimal input, improving go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces vitrified samples suitable for single-particle cryo-EM, enabling quantitative structural readouts that can inform binding affinity and conformational dynamics in assay development.
- Operational Value: Uses a dispensing system with sub-nanoliter precision, ensuring reproducible sample deposition across grids and supporting assay standardization.
- Scalability: The macro-driven automation allows consistent processing of multiple samples, facilitating medium-throughput screening campaigns when integrated with robotic sample handling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables structural follow-up of biomarkers identified in phenotypic screens, linking target engagement to atomic-level mechanism.
- Mechanistic De-risking: Facilitates visualization of protein complexes, post-translational modifications, or mutation effects in disease-relevant systems without requiring large-scale protein production.
- Quantitative Readiness: The method’s ability to prepare “lossless” total sample supports accurate quantification of complex mixtures, aiding in biomarker validation and pharmacokinetic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural insight and enabling progression to lead identification by reducing biological uncertainty in protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing high-resolution structural data on protein targets, clarifying binding sites and mechanistic function from limited samples.
- Screening: Delivers assay-ready grids with standardized sample thickness and ice quality, improving reliability in downstream screening and hit validation.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as particle distribution, ice thickness, and molecular occupancy, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing structural analysis of disease variants or biomarker candidates derived from patient samples or single-cell lysates.
- Enterprise Reuse: The automated macro script and temperature-controlled platform create a reusable infrastructure for structural proteomics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target structure and function, reducing ambiguity in mechanistic interpretation.
- Operational Value: Eliminates variability introduced by manual blotting, improving reproducibility and throughput in grid preparation.
- Strategic Value: Lowers the barrier to studying challenging targets, enabling broader exploration of the proteome and reducing reliance on overexpression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural evidence early in the discovery pipeline, de-risking investment in high-value targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample preparation, microfluidic handling, and macro-based automation systems.
- Dependent on specialized instrumentation including a cryogen container, ethane plunge system, temperature-controlled stage, and precision microcapillary dispenser.
- Necessitates standardization of environmental controls (humidity, temperature) to ensure consistent sample vitrification across runs.
- Adaptation to different sample types (e.g., membrane proteins, complexes) may require optimization of buffer conditions and blotting alternatives.
- Practical limitations include the need for hazardous material handling (liquid ethane, nitrogen) and initial setup complexity, though operational simplicity improves post-training.
