Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Elektroporatie verhoogt tijdelijk de permeabiliteit van het celmembraan door middel van elektrische pulsen met hoge spanning. Er zijn verschillende zich snel ontwikkelende klinische behandelingen op basis van elektroporatie die gericht zijn op spier- en neuronale cellen. Het is dus van cruciaal belang om te onderzoeken hoe elektroporatie het vermogen van deze exciteerbare cellen om actiepotentialen te activeren beïnvloedt.

In-vitro-experimenten zijn erg belangrijk om de effecten van elektroporatie op prikkelbare cellen te begrijpen. Primaire myocyten en neuronen hebben echter een zeer complex ionkanaalexpressieprofiel dat het uiterst uitdagend maakt om het samenspel tussen excitatie en elektroporatie te ontwarren. We hebben een protocol ontwikkeld om door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in de generatie van actiepotentiaal te monitoren met behulp van tet-on spiking HEK-cellen.

Deze cellen brengen een minimale aanvulling van natrium- en kaliumkanalen tot expressie waardoor ze prikkelbaar zijn. Daarom vereenvoudigde deze cel de experimenten en de theoretische analyse van de verkregen resultaten. Met behulp van ons protocol ontdekten we dat zeer milde elektroporatie de acceptatie van cellen al dramatisch kan beïnvloeden.

Deze resultaten zullen de weg vrijmaken voor het ontwikkelen van theoretische modellen van elektroporatie en celacceptatie, en dit zal de gemeenschap helpen om de snel opkomende op elektroporatie gebaseerde therapieën in het hart, de hersenen en skeletspieren te verbeteren. Pipetteer om te beginnen een milliliter PBS in een putje van de glazen kamerglaasjes met twee putjes. Voeg 10 microliter steriele, één milligram per milliliter poly-L-lysineoplossing toe en meng goed met een pipet.

Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap en verwijder vervolgens de PBS met poly-L-lysine zonder verder te wassen. Om de cellen te zaaien, bereidt u een één-tot-10 verdunning van doxycycline-stockoplossing in een kweekmedium in een tube van 1,5 milliliter. Verwijder nu het kweekmedium uit de T-25-kolf.

Trypsiniseer de cellen met 2,5 milliliter trypsine EDTA-oplossing in een kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten. Voeg 2,5 milliliter vers kweekmedium toe en pipetteer voorzichtig de cellen om ze los te maken van het oppervlak. Bereken het volume van de getrypsineerde celsuspensie die nodig is om de cultuur tot stand te brengen.

Trek het eerder berekende celsuspensievolume af van 1.470 microliter om het volume van het kweekmedium te berekenen. Om monsters met exciteerbare S HEK-cellen te bereiden, pipettert u het berekende volume van het kweekmedium en de trypsine-celsuspensie in één putje. Voeg 30 microliter van de doxycycline-verdunning toe.

Meng goed door voorzichtig te pipetten vlak voordat u de kamers in de kooldioxide-incubator plaatst. Voor het voorbereiden van monsters met niet-exciteerbare NS HEK-cellen, pipettert u het berekende volume kweekmedium in een putje en voegt u 90% van het berekende volume celsuspensie toe voor S HEK-cellen zonder doxycycline. Incubeer de kamers in een 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen voorafgaand aan het experiment.

Pipetteer vóór het experiment drie microliter potentiometrische kleurstofoplossing in een buisje van 1,5 milliliter. Laat de open buis ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur in een laminaire stromingskap staan om de ethanol te laten verdampen en de potentiometrische kleurstof te laten drogen, en voeg vervolgens 997 microliter koud kweekmedium van vier graden Celsius toe aan de buis om de kleurstof op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 12 micromolair. Verwijder vervolgens het kweekmedium uit het putje.

Voeg een milliliter potentiometrische kleurstofoplossing toe aan de cellen. Zet de cellen in de koelkast bij vier graden Celsius en incubeer ze 20 minuten. Verwijder daarna de potentiometrische kleurstofoplossing en bewaar deze in een tube voor verder hergebruik voor maximaal zes opeenvolgende experimenten op één dag.

Was de cellen drie keer voorzichtig met tyrode-oplossing. Pipetteer na de laatste wasbeurt een milliliter tyrode-oplossing met een laag kaliumgehalte in het putje. Bereid om te beginnen de HEK-cellen voor op elektroporatie en configureer vervolgens de synchronisatie van de pulsafgifte met beeldacquisitie met behulp van een TTL-signaal van het microscoopsysteem dat de pulsgenerator activeert.

Plaats op de bodem van de kamer twee parallelle platina-iridiumdraadelektroden met een diameter van 0,8 millimeter en een afstand van vijf millimeter tussen de binnenranden. Bevestig de kamer onder de microscoop en sluit vervolgens de elektroden aan op de pulsgenerator. Sluit met behulp van een spannings- en een stroomsonde de uitgang van de pulsgenerator aan op een oscilloscoop om de juiste pulsafgifte tijdens het experiment te kunnen verifiëren.

Richt de cellen op het heldere veld en stel de cellen in het midden tussen de elektroden in beeld. Verkrijg 80 foto's in de time-lapse-modus met een snelheid van ten minste 25 frames per seconde. Verlicht de cellen met een excitatiegolflengte van 635 nanometer, stel de belichtingstijd in op 10 milliseconden en detecteer de emissie op ongeveer 700 nanometer.

Wacht na de overname twee minuten. Stel de spanning op de interface van de pulsgenerator in op 63 volt. Neem elke twee minuten op dezelfde manier een time-lapse op.

Pas tijdens deze acquisities een enkele puls van 100 microseconden toe op het moment dat het 10e beeld wordt verkregen. Verkrijg afbeeldingen met pulsspanningen van 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 en 200 volt. Schat het elektrische veld waaraan de cellen worden blootgesteld als de toegepaste spanning-elektrode-afstandsverhouding.

Voor gegevensanalyse exporteert u de time-lapse-opnamen naar het TIFF-formaat en plaatst u vervolgens alle time-lapse-opnamen van de toegepaste spanningen van een afzonderlijk experiment in één map. Wijzig de naam van elke time-lapse-opname zodat MATLAB het elektrische veld kan herkennen. Voor de acquisitie aan het begin van het experiment, waarbij geen puls wordt toegepast, wijzigt u de naam met de zin 000Vcm.

Open vervolgens de applicatie die is gedownload van GitHub. Klik op Gegevensmap selecteren" om de map te kiezen met de time-lapse-opnamen van één experiment. Om de pixels te selecteren, gebruikt u twee schuifregelaars om de lage drempel te bepalen voor een duidelijk beeld van de membranen en de hoge drempel voor het verwijderen van puin uit de analyse.

Klik nu op Gegevens analyseren. Op het tabblad Analyse verschijnt een tabel met geëxtraheerde parameters. Aan de rechterkant van de tabel worden grafieken weergegeven van relatieve fluorescentie in de loop van de tijd voor elk gebruikt elektrisch veld.

Selecteer de grafieken voor een bepaald elektrisch veld in het dropdown menu aan de linkerkant boven de tabel. Bekijk alle grafieken en voer handmatige correctie uit in het geval van detectie van valse pieken. selecteer AUTO-pieken wissen "onder aan het tabblad Analyse" om de automatisch gedetecteerde pieken te wissen.

Klik op de grafiek om handmatig een nieuw piekmoment te bepalen. Selecteer indien nodig AUTO-piekdetectie opnieuw uitvoeren"onderaan het tabblad Analyse" om automatische piekdetectie opnieuw uit te voeren. De geëxtraheerde parameters worden nu aangepast aan de nieuwe piek.

Selecteer daarna Gegevens exporteren"rechtsonder op het tabblad Analyse" om gegevens te exporteren naar dezelfde map als een dotmap-bestand, een spreadsheetbestand en PNG-afbeeldingen voor elk elektrisch veld dat wordt gebruikt. Elektrische pulsen van 126 volt per centimeter veroorzaakten meerdere fluorescentiepieken in exciteerbare cellen, zoals blijkt uit de verschillende oscillaties in de fluorescentieverandering in de loop van de tijd. Met toenemende elektrische veldsterkte veranderde de respons en vertoonde een aanhoudende depolarisatie bij 400 volt per centimeter.

Niet-exciteerbare cellen vertoonden geen significante pieken als reactie op de laagste elektrische veldsterktes, wat wijst op geen excitatie. Bij hogere sterktes van het elektrische veld vertoonden de niet-prikkelbare cellen ook aanhoudende depolarisatie, wat wijst op elektroporatie. Het maximale aantal pieken in prikkelbare cellen werd waargenomen bij 150 volt per centimeter, met een afnemende trend in het aantal pieken naarmate de spanning voorbij dit punt toenam.